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2型糖尿病相关基因的研究

发布时间:

河北医科大学 硕士学位论文 2型糖尿病相关基因的研究 姓名:吴迪 申请学位级别:硕士 专业:神经病学 指导教师:吕佩源 20070301

中文摘要

2型糖尿病相关基因的研究
摘 要

目的:糖尿病(diabetes

mellitus,DM)和肥胖

(obesity’OB)均是由遗传因素和环境因素相互作用而引起的

代谢异常性疾病。大量的研究结果表明,基因的多态性与肥
胖和糖尿病的发生有着密切的关系,基因的多态性是肥胖和 糖尿病发生的重要遗传因素。 线粒体内含有DNA,还含有自身的蛋白质合成系统,是核

外的另一遗传基因携带体。细胞核基因遗传和线粒体基因遗
传虽各自相对独立,但二者之间也存在相互依存,相互影响。 目前,核基因组(nDNA)和线粒体基因组(mtDNA)基因 变异导致糖尿病发生的研究均取得了一定的进展,而对于肥 胖的发生,学者们的关注点仍停留在肥胖与生活方式与饮食 结构的关系上,肥胖易感基因的研究只限于核基因的筛查, 尚未涉及到线粒体基因。 核基因Foxa2(Forkhead boxa2)是翼螺旋转录因子 家族的一个成员,Foxa2是肝脏重要代谢基因的转录激活因 子,其活性可以被胰岛素抑制。有研究证实,空腹状态下,低 胰岛素水*可激活Foxol和Foxa2,Foxol的激活可导致葡萄糖 异生增加,Foxa2的激活则导致脂肪酸B氧化及酮体形成增 加和极低密度脂蛋白合成增多。在胰岛素抵抗状态下,减弱的 胰岛素信号不能抑SUFoxol但能抑¥lJFoxa2的活性,导致葡萄 糖异生增加,脂肪酸B氧化减少和极低密度脂蛋白合成减少,

这些改变可导致2型糖尿病的发生。

中文摘要

*年来,线粒体基因突变导致糖尿病发生的研究也取得 了很大的进展,约有10余种线粒体基因突变被发现与糖尿病

发生.的乏。迄今为止,国内外还没有关于线粒体基因突变导
致肥胖发生的相关性研究的报道。但是,线粒体的氧化磷酸 化过程与人体的能量代谢密切相关,而且线粒体呼吸链中多 肽功能的异常或量的减少,可干扰三羧酸循环的顺利进行, 因此线粒体的异常也可能对肥胖的形成有一定的影响。 因此,在核基因组方面,本实验通过对大连市2型糖尿 病患者的外周血白细胞中的foxa2基因的启动子(promotor) 和外显子(exon)区域进行测序,筛查突变点(SNP),并进一 步观察基因突变造成的Foxa2基因功能异常与2型糖尿病之

间的关系。在线粒体基因组方面,从w唧.mitomap.org提供
的众多mtDNA SNP中选取了在日本2型糖尿病人群测序中发现 的但在国内外未被报道的与2型糖尿病和肥胖有关联的 mtDNAA3537G、A4824G、A53516、C6960T作为研究位点,研究 线粒体DNA突变与肥胖和2型糖尿病的关系。 第一部分:foxa2基因突变与2型糖尿病相关性研究

研究对象和方法:检测人群均来自大连市2型糖尿病患 者,其中包括2005年1月至2006年2月大连地区2型糖尿
病家系调查中收集到的患者61人(每家系中随机选取1人),

国家96攻关糖尿病普查大连地区散发2型糖尿病患者56人
以及大连市中心医院内分泌科住院的糖尿病患者28人,共 计145人,其中男性63人,女性82人。*均年龄56.56±13.62 岁。非糖尿病者(NGT)均是普查中的健康人群,共334人, 其中包括男性188人,女性146人,*均年龄52.3l±10.59 岁。健康人群入选标准为空腹血糖<5.6mmol/L,

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0GTT<7.8mmol/L,无其他内分泌疾病,无糖尿病家族史。确 定样本后,采集血样,提取有核细胞基因组DNA,根据Foxa2 序列设计引物,用多聚酶链反应技术(PCR)扩增含有foxa2 基因启动子和外显子所在的基因片断,对基因片断进行测 序,筛查突变点(s艘)。 结果:本实验利用PCR技术对大连市2型糖尿病病人及 健康人外周血自细胞DNA中Foxa2基因的编码区域进行扩增, 对扩增片断进行测序。与健康人群对照,在foxa2基因启动 子和外显子所在的基因片断上未发现SNP。 结论:在大连市2型糖尿病病人Foxa2基因启动子和外 显子区域内未发现突变点,说明foxa2可能为高度保守性基 因,大连2型糖尿病人群的糖尿病发病并非由Foxa2的基因 突变所引起,而可能是由转录调节因子复合物中其他调节子 的变异所致。 第二部分:线粒体DNA A3537G、A482zig、A5351fi、C6960T 4 点多态性与肥胖及2型糖尿病的相关性研究 对象及方法:研究对象均来自广西公务员体检人群中的超
重和肥胖患者,共计496人,其中超重患者96人,男性60

人,女性36人,*均年龄46.33±6.25岁;肥胖患者400
人,其中男性280人,女性120人,*均年龄47.52±3.85

岁。对照组为广西地区体检的健康对照人群137人,其中包 括男性48人,女性89人,*均年龄45.47±5.50岁,BMI<23。 确定样本后,采集血样,提取有核细胞基因组DNA,根据线 粒体DNA序列设计引物,用多聚酶链反应技术(PcR)扩增
含有A3537G、A4824G、A5351G、C6960T的所需片段,片断

长度分别为557bP、658bP、505bP,541bP,然后分别用AluI、

中文摘要

BstEII、HhaI、BgII内切酶在37。C恒温空气循环箱中消化过 夜,以8%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离酶切产物,鉴别不 同的基因型(AA、GG、CC、TT)。分别比较超重/BE胖组与对 照组,同时对四个位点所构成的单倍型进行分析。 结果 1广西人群肥胖实验分组标准应该采用2000年国际肥胖 特别工作组提出的亚洲成年人BMl分组标准。 2在mtDNA
A3537G.A4824G,AS351G,C6960T

4点多态性

与肥胖的相关性研究中发现,只有A5351G点突变率在单纯肥 胖组与健康对照组的比较中有显著的统计学差异:X2=7.41,
P=O.006,OR=3.53,9596CI=1.35~6.29。由于A5351G是同

义突变,因此提示A5357G突变点周围可能存在与广西体检 人群肥胖相关的连锁不*衡风险基因突变位点,而与广西体 检人群超重没有相关性。 3在mtDNA
A3537G.A4824G,A5351G,C6960T

4点多态

性与肥胖伴糖尿病的相关性研究中发现,4点突变率在OB+DM 组和对照组间均无统计学差异,提示4点突变可能与广西体 检肥胖患者中糖尿病的发生无相关性。 4在mtDNA
A3537G.A4824G,A5351G,C6960T

4点多态

性与肥胖伴糖耐量异常(IGT)的相关性研究中发现,只有 A5351G点突变率在OB+IGT组和对照组间存在统计学差异: r=8.296,P=O.004,OR=4.40,95%CI=1.49~9.63。由于A5351G 是同义突变,因此提示,A5351G突变点周围可能存在与广西 体检肥胖患者中糖耐量异常发生相关连锁不*衡风险基因 突变位点。 5在mtDNA
A3537G.A4824G,A5351G,C6960T

4点多态

中文摘要

性与超重(ow)伴糖尿病/糖耐量异常的相关性研究中发现,4
点突变率在OW+DM+IGT和对照组问均不存在统计学差异。提 示,mtDNA A3537G.A4824G,A5351G,C6960T 4点突变与超

重组糖尿病/糖耐量异常无明显相关性。
6 mtDNA

A3537G.A4824G,A5351G,C6960T4点共检出5种

单倍型,只有单倍型从Gc(G为5351点A突变成G)在病例 _对照组的分布有显著性差异(freq=O.092,P=4.OE-4)。 结论:mtDNA A5351G突变点可以做为广西人群肥胖和 肥胖伴糖耐量异常人群的基因标记点。在它的周围可能存在 与广西人群肥胖和肥胖伴糖耐量异常发生相关的连锁不* 衡风险基因突变位点。单倍型AAGC是一种风险基因型,当 生活水*日益提高时,使存在有此基因的人可能极易迅速超 重或肥胖,并导致糖耐量异常,增加患2型糖尿病的危险。

关键词;基因多态性;foxa2;线粒体DNA;肥胖;2型 糖尿病;单倍型

英文摘要 Investigation of type 2 diabetes mellitus related gene

Objective:Obesity(OB)and
the cffect of

diabetes

mellitus(DM)are

metabolic diseases induced by abnormal genes expression and environment.Genetic
factor participates

pathogenesis in defferent types of OB and DM.A lot of research
results indicate that gene polymorphism is related closely pathogenesis of OB and
to

DM.
genes

Mitochondrie

contents

and system of protein synthesis.

Mitochondrie is unique cell organ taking along genetic maiteral
besides cell

nucleus.Mitochondrial gene(mtDNA)and/or
are interdependency and interactive

nuclear gene(nDNA) each other. Great

researches in the relation of mtDNA and/or nDNA

mutation and pathogenisis of DM wen achieved in the last
several years.But now,investigator have been focused
on

the

relation of the morbidity of OB and life style and food structure.
The research about the OB predisposing genes screening

mainly

focus

on

the nDNA witIlout mtDNA.
all

Foxa2 is the

important activating
can

transcription

factor(ATF)in


liver.ne

gene

be inhibited by insulin.Foxol is
to

key

switch regulation maiteral liver in

fatty acid decomposition in the

the condition of empty stomach,and Foxa2 is mainly
can

promote the glyconeogenesis.Low insulin level


activate

英文摘要
Foxol and Foxa2.Foxol activation may lead to in.ease of gluconeogenesis.Foxa2 activation might lead to oxidation of fatry acid B and production of ketobodies and very low density

lipoprotein(VLDL).In
induce to oxidation and

the state

of iIlsIlliIl resistance,Foxa2 was

inhibited by lower insulin signal but Foxol Was not,which
all

inhere of gluconeogenesis and decrases of
production of ketobodies of these metabolic

of fatty acid B oxidation
density

very low
are

lipoprotein.All

disturbances
Great leading to

related dosdy to pathogenesis of

T2DM.

advance is achieved in the role of mtDNA mutation DM in the last several years.More than
ten
no

of mtDNA
correlation

mutations related with DM were found.But
research
on

mtDNA mutation leading to OB is reported in the oxidative phosphorylation is related

world.Mitochondrial

closely to human energy metabolism.Decrease

and

dysfunction
can

of polypeptide iIl the mitocbondrial respiratory chain oxidative phosphorylation

affect

and

interfere

TCA

cycle.So
on

mitochondfial dysfunction may be have metabolism and morbidity of OB.

801110

effects

litIid

Therefore,we investigated the relationship between the foxa2 gene variant in nDNA

and

type 2 diabetes meUitus,In the

mtDNA,A3537G,A4824G,A5351G,C6960T were investigated
which were found in

Japanese T2DM
never

patiens

sequencing

(www.mitomap.org),but
related with

reported

that these

gem are

DM

or

OB by now.



英文摘要
Part 1:Association of the foxa2 gene variant with typc 2

diabetes mellitns

Methods:145
women were non-diabetic
or

patients with

T2DM includs 63 men and 82

examined.Mean age was 56.56_+13.62yers.334

subjects

with fasting glucose less

than 5.6 mmol/L

OGTT glucose less than 7.8 mmol/L includs 188 mell and

146

women.Mean age was 52.31+10.59 yers.In Dalian Han

nationality were selected.DNA was isolated from peripheral blood

cell according
of Foxa2
exon

to

standard Sense

procedllres.According to the anti—sense primers of the

sequence

and

promoter and

were designed according to the sequence of

Foxa2 gene 1253bp、195bp、1677bp fragments

and

fragments

were amplified by polymerase chain reaction.Those areas were sequencinged
to

look for SNP.

Result:The SNP in the areas of Foxa2’S promoter
exon

and

Was not found in patients with T2DM of Dalian Han

nationality.

Conclusions:Foxa2 is



conservatism gene.It is

not

related with the morbidity of type 2 diabetes mellitus in Dalian Han nationality.11le other transcription regulatory factor of the compounds maybe have effect

in inducing type 2 diabetes

mellitus.
Part 2:Study of correlations among

mitochondrial DNA

A3537G,A4824G,A5351G C6960T polymorphisms and
obesity and type 2 diabetes mellitus

Subjects:496

Guangxi

officials


who were recewed health

英文摘要
examination and diagnosed
as

overweight

or

obesity were

enrolled in the stIld弘96 with overweight including 60 men and

36 women were examined.Mean age Was 46.33+6.25 years.400

嘶th obesity

including 280 men and 120 women were examined.

Mean age was 47.52±3.85 years.137 healthy people who were
received health examination in Guangxi province were enrolled

as controls.

Methods:Genomic DNA
blood

was extracted from peripheral designed

karyocytes,primer

Was

according

to

mitochondrial DNA sequence.Fragments including A353713I A4824G‘A5351G C6960T gene mutation sites were amplified
by polymerase chain

reaction(PCR),the

length of the fragments

were 557bP,658bP,505bP and 541bP respectively,then were
digested with AluI,BstEII,HhaI,Bg II incision

enzymes

respectively in 37℃thermotank for 12 hours. The products were separated by electrophoresis polyacrylarnide
on a

8%

gel(PAGE),genotypes
and

were

identified(A~

GG,CC,TI.),and were compared among
obesity group control
at

verweight
sites

group,

group,the



constructed

haplotypes were analyzed

the

Same time.
BMI classification

Results:(1).The classification of overweight and obesity for

Guangxi population

should be the Asia adult

proposed by 2000 intemational obesity special team.(2).In the
study of

correlations

among

mtDNA A3537G,A4824G,
and obesity,significant

A5351G'C6960T polymorphisms

difference was only found in A5351G point mutation between



英文摘要
pure OB group and healthy

group(X2=7.41,P=0.006,
the A5351G mutation was

OR=3.53,95%CI=1.35—6.29).but
genetic mutation may exist

silent mutation,it suggest that some linkage disequilibrium risk point mutation beside A5357G

associated with obesity in Guangxi of correlations

population.(3).In the

study

among mtDNA A3537G,A4824G,A5351 G.

C6960T polymorphisms

and

OB

accompanied variant

with

DM,no

significant difference was found in the

rate

of the 4 point

mutation between OB+DM group and healthy group(XZ=7.41,

P=0.006,OR=3.53,95%0=1.35-6.29).It
mutation has
no

suggest the 4 point

correlation with

DM in the obesity patients.(4).

In the study of correlations among mtDNA A3537G,A4824G, A5351G,C6960T polymorphisms and obesity

accompanied

with IGT,significant difference Was only found in A5351G point mutation between OB+IGT

group

and

control
the

group(XX=8.296,P=0.004,OR=4.40,95%CI=1.49—9.63).but
linkage disequilibrium risk genetic mutation may exist

A5351G mutation was silent mutation,it suggest that some

poim

mutation beside A5357G associated with

IGT

in Guangxi

population.(¥In the study

of correlations among mtDNA and

A3537G,A4824G,A5351G,C6960T polymorphisms
overweight accompanied

with

DM/IGT,no

significant

difference Was found in the variant rate of the 4 poim mutation
among

OW+DM/IGT group correlation

and

healthy

group(XZ=7.41,

P=0.006,OR=3.53,95%CI=1.35—6.29).It
mutation has
no

suggest the 4 point

with

OW+DM/IGT in the obesity

英文摘要

patients.(吼Haplotypes were

detectcd

from

the

nⅡDNA AAGC

A3537GA4824G,A5351G,C6960T mutations,only

haplotype(G Was 5351 A mutated to G)has significant
distribution in case-control groups.

Condufions:mtDNA A5351G mutation site genetic mark in Guangxi population with OB
linkage
or

can

be

used弱

OB+IGT.Some
exist

disequilibrium

risk

genetic

mutation maybe

beside A5357G associated with 0B and OB+IGT in Guangxi population.AAGC haplotype is
of
a high

risk genotype.So,the risk

T2DM could increase with the living standard improving in

population with AAGC haplotype.

Keywords:gene

polymoephism;mitochondrial

DNA;

obesity;type 2 diabetes mellitus;haplotype

11

研究论文

2型糖尿病相关基因的研究
引 言

糖尿病和肥胖是由遗传因素和环境因素相互作用而引 起的代谢异常性疾病。大量的研究结果表明,基因的多态性 与肥胖和糖尿病的发生有着密切的关系。基因的多态性是肥 胖和糖尿病发生的重要遗传因素。 目前,核基因组(nDNA)和线粒体基因组(mtDNA)基因 变异导致糖尿病发生的研究取得了一定的进展,而肥胖的发 生,研究者多关注生活方式与饮食结构在肥胖发生中的作 用,肥胖易感基因的研究仅仅停留在核基因的筛查上,尚未 涉及到线立体基因。 因此,本实验在核基因组方面观察了foxa2基因与2型糖 尿病发生的关系,在线粒体基因组方面,观察了线粒体DNA
A3537G、A4824G、A5351G、C6960T

4个突变点与肥胖和2型

糖尿病之间的关系。

研究论文

第一部分:foxa2基因与2型糖尿病相关性研究





2型糖尿病是一种常见的具有明显异质性的多因素、多 基因遗传性疾病,其遗传方式和发病机制十分复杂,环境因 素与遗传因素的交织作用共同促成了2型糖尿病的发生。

Foxa2是调节空腹时肝脏分解脂肪酸的关键开关。Foxol的 主要作用是促进空腹时肝脏糖异生。空腹状态下,低胰岛素
水*可激活Foxol和Foxa2,Foxol的激活可导致葡萄糖异生 增加,Foxa2的激活导致脂肪酸B氧化及酮体形成增加和极 低密度脂蛋白(VLDL)合成。在胰岛素抵抗状态下,减低的 胰岛素信号不能抑制Foxol但能抑制Foxa2,结果导致葡萄 糖异生增和脂肪酸B氧化减少、VLDL合成及分泌减少,这些 均与2型糖尿病的发生密切相关n1。

鉴于foxa2在糖尿病发生中的作用,所以本实验通过对
大连市2型糖尿病患者的foxa2基因的启动子(promotor)和 外显子(exon)区域进行测序,筛查突变点,从而探讨基因突 变造成的Foxa2基因功能异常与2型糖尿病发生之间的关
系。

材料与方法

1研究对象 研究对象均来自大连市。T2DM患者包括2005年1月至 2006年2月大连地区T2DM家系调查中收集的T2DM患者61

研究论文

人(每家系中随机选取1人),国家95攻关糖尿病普查大

连地区散发T2DM患者56人,以及大连市中心医院内分泌科
住院的糖尿病患者28人,共计145人,其中男性63人,女 性82人,汉族,*均年龄56.56±13.62岁。非糖尿病者(NGT) 均是普查中的健康人群,共334人,其中包括男性188人, 女性146人,*均年龄52.31±10.59岁,空腹血糖 <5.6mmol/L或OGTT血糖<7.8mmol/L,无其他内分泌疾病, 无DM家族史。

2试剂吲义器
2.1主要实验仪器
PCR system 2400、PCR
system

9700为GeneAmp公司产

品。2117
DYY—III

M11

itiphorlI电泳仪为LKB bromma公司产品。

24D型电泳槽、ECP3000型电源为北京市六一仪器

厂产品。贝克曼台式离心机、恒温空气循环箱为Heraeus公 司产品。恒温水浴为PharmaciaBiotech公司产品。Gel 2000凝胶成像分析系统为BIO PAD公司产品。 2.2所用试剂及配方 EDTA、SDS、Tris碱、硼酸,蛋白酶E、无水乙醇、75% 乙醇、生理盐水均购白北京化学试剂公司。Taq DNA聚合酶
(2 units/u L),DNA marker(分子量标记)SDOIl购自北
Doc

京鼎国生物技术发展中心。dNTPs(i0 mM)、丙烯酰胺购自 北京赛百盛基因技术有限公司。DNA 京天来生物医学科技有限公司。 2.2.1提取DNA所用试剂及配方 ①红细胞裂解液(灭菌):蔗糖10.9
m1,IM Tris-HCl 1 ml,Triton X-i00 1 g,IM MgCl2 0.5 Ladder

Marker购自北

ml,加水定容至

研究论文
i00

ml,4。C保存。 ②3XMLB(白细胞裂解液):1
M Tris-HCl PH=8.0 3 PH=8.0 6 ml,5 M№lcl 6 ml,20%SDS 300|I 1,DTT 0.18

ml,0.5 M EDTA
30 m1,20

mg/ml蛋白酶K

g,加水定

容至i00 ml,分装成50 ml/管,-20℃保存。(EDTA:乙二 胺四乙酸)。

③TE_I(灭菌):1
M EDTA 200




Tris-HCl(PH=8.0)1 m1,0.5

1,加水定容至100 ml,高压灭菌,4。C保

存。

④TE-II(溶解DNA用)(灭菌):1
1 ml,0.5 M EDTA 20|I



Tris—HCI(PH=S.0)

1,加水定容至i00 ml,高压灭

菌,4℃保存。 ⑤20%SDS:十二烷基硫酸钠20 g,加水定容至i00 ml。 ⑥1 MTris(PH=7.5)(灭菌):三羟甲基氨基甲烷12.11 g,NaOH调节PH,加水定容至i00 ml,412保存。

⑦0.5M EDTA,PH=8.0(灭菌):EDTA?2H20
H20 70

18.6 g,

ml,加适量的NaOH约2 g,调PH=8.0,加水定容至
g,H20 80 ml, ml。

i00 m1。

⑧1

M Tris-HCl PH=8.O-Tris

12.1

加37%HCI约4.2 m1,调节PH=8.0,加水定容至100

2.2.2电泳试剂配制 ①5×TBE电泳缓冲液:称量Tris碱1089,硼酸559,
加入装有800ml蒸馏水的烧杯中,再加入0.5mol/L
EDTA

(PH=8.0)40ml,混匀后加蒸馏水定容至1000ml,常温贮存 于棕色瓶子中。用时稀释到1×(聚丙烯酰胺电泳)。

②0.5mol/g EDTA(PH=8.O):称量186.ig

EDTA-Na2H20

研究论文

加入装有800ml蒸馏水的烧杯中,用磁力搅拌器剧烈搅拌, 用Na0H调PH值至8.O(需加入NaOH将PH值调至接*8.0时, 才能完全溶解,约需209Na0H颗粒),定容至1L,分装后高 压灭菌备用。 ③30%聚丙烯酰胺凝胶(29:1):称量丙烯酰胺299,N, N,-亚甲基双丙烯酰胺lg,加蒸馏水混匀后定容至100ml,常 温贮存。 ④10%过硫酸胺:称量过硫酸胺lg,加蒸馏水10ml, 混匀后可于4"C贮存数周。 ⑤6


loading

buffer:称量3.729 EDTA-Na2H20加

入蒸馏水90ml,充分溶解后调PH值至8.O(或用20ml
0.5mol/L EDTA(PH=8.0)),在溶液中加入lg SDS,0.259溴

芬兰,0.259二甲苯青,209聚蔗糖(Ficoll 400),充分混 匀后加蒸馏水定容至100ml,常温贮存备用。 3实验方法 3.1基因组DNA的提取(盐析法) 从-8012冰箱中取出准备好的冻存血2ml,加入4倍体积 裂红液(O一5℃),混匀,离心,2500rpm,lOmin,弃上清。 重复一次,至细胞团呈粉色;加入8倍体积生理盐水,混匀, 离心2500 rpm,lOmin,弃上清;加3ml裂白液、10mg/ml 蛋白酶E
200u l、10%SDS 400|I

l,混匀,37℃温浴过夜;

加入1/4体积饱和Natl,颠倒混匀,离心,2500rpm,20min; 吸上清于试管中,加入2倍体积冷无水乙醇,轻摇至DNA析

出,用70%乙醇洗DNAl’3次,真空干燥,溶于TE缓冲液,
--200C保存。
3.2

PCR反应

研究论文

3.2.1引物设计 根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)收录的Foxa2 基因全序列,使用GeneTool软件对foxa2的启动子 (promoter)和3个外显子(exonl,exon2,exon3)进行设计引 物。由于exon3长1677bp,因此分成2部分(exon3-1,exon3—2) 设计引物。引物信息如下:

引物序列(方向:5’-*3’)
位置 上游 下游

产撇(bp)
1253

Tm(℃)

P&el

TCCCATCCA CGCGCl-AGG T

GCCGGGTTTCTTC

66.3

GCTCTCAG

强∞2

GGTGATTGC TGGTCGTTT G

CTGAGGTTG(;GGA AGGAG

195

64

Exon3 -1

GGCGAGGTG GAGAAGGGC

GcGCAGGTAGCAG CCGTTcT

1107

56

删G
Exon3 -2 CGCCAcTcG CTCTCCTTC AAC

GCCcGCAQ姐ACC

1100

55

峨h~峨飞味c

17

研究论文

3.2.2反应体系 反应体系如下表:

Taq

DNA聚合酶

0.5 2

p1

10×PCR buffer (NrPs

ul

0.4p1 2U1

眦模板

上溯l物 下潲l物
H20

0.3p1
0.3ul 14.5ul

3.2.3反应条件
窟动予秘
exonl F强on2 95℃420S 95℃420S 95"C420s 94’C30s 94"C30s 94‘C30s 64℃30s 56℃30s 55*C30s 72"C60s 72。C60s 72‘C60s 72"C420s 72℃420s 72。C420s
35

95℃420s

94"C30s

66.3%。30s

72。C60s

72。C420s

35

ExmY-1
Exon3-2

35 35

3.2.4

PCR对目的片断进行扩增(见Fig卜1到Fig卜3)

3.3各区域片断测序分析(见Fig 1-4到Fig 1116) 所有PCR扩增产物送北京华大中生科技有限公司测序。
利用DNAStar4.0软件将所有测序结果与GenBank提供的启

动子和外显子序列进行比对分析寻找突变。
结 果

在北方大连糖尿病患者组和非糖尿病正常对照组中, Foxa2基因启动子和外显子l的测序结果并未发现突变点。

研究论文





Fig 1-1 electrophorctogram ofpromoter&exonl offoxa2 .1、2:promoter&exonl PCR production,3、DL2000 marker

Fig 1-2 electrophoretogram of exon21,2:exon2 production,3.markerl

19

研究论文

exon3-1PCR production,2: Fig 1-3 electrophoretogram of exon3,h exon3-2 PCR production,3 DL2000 marker

240 230 CC GG CG CCTG G CG CA矗G C

Fig 1-4 Part of sequencing result

011

promoter and exonl of foxa2

研究论文
S0 60 :C矗CG T TC五CT矗CG T矗

Fig 1-5 Part ofsequencing result

oll

exon2 of foxa2

380 390 r TG CCTTCC矗G CCTC矗CCC

450 460 :C矗CC矗丁CG CCCCC矗A TTTTG

Fig 1-6 Parts of sequencing result

on

exon3 of foxa2

研究论文





foxa2是胰岛素信号进入体内促进相应蛋白表达的重要 转录调节因子。在转录过程中,由多个调节因子共同组成的 转录调节因子复合物在共同起作用,Foxa2是其中之一。在 本试验中,在Foxa2基因启动子和外显子区域内并未发现突 变点,因此考虑大连2型糖尿病人群的糖尿病发病并非由 Foxa2的基因突变所引起,而可能是由转录调节因子复合物 中其他调节子的变异所致。具体是哪个调节因子的异常导致 了大连人群的糖尿病的发生还需要进一步的研究证实。 小 结

在大连糖尿病患者Foxa2基因启动子和外显子中并未发 现突变点。大连2型糖尿病人群的糖尿病发病并非由Foxa2 的基因突变所引起。

研究论文

第二部分:线粒体DNA

A3537G、A4824G、A5351 G、

C6960T多态性与肥胖及2型糖尿病的相关性的研究
前 言

肥胖和糖尿病是由遗传因素和环境因素相互作用而引

起的代谢异常性疾病。相关基因的多态性与肥胖和糖尿病的
发生有着密切的关系,是多基因共同作用的结果。目前,线

粒体基因突变导致糖尿病发生的研究取得了很大的进展,约
有10余种线粒体基因突变被发现与糖尿病发生有关。而线

粒体基因突变导致肥胖发生的研究尚未报道。因此,我们从 www.mitomap.org提供的众多mtDNASNP中选取了在日本2型糖尿
病人群测序中发现,但国内外未报道与2型糖尿病和肥胖关 联的四个距离相*的位点作为研究位点(mtDNAA3537G、

A4824G、A5351G、C6960T)。应用PCR—RFLP技术检测广西地
区汉族人496例肥胖病和137例健康对照者外周血白细胞中 这四个位点的变异情况,并对这4个位点进行单倍型分析,

探讨这些变异与肥胖及2型糖尿病的关系。希望能够发现线
粒体基因异常与肥胖的相关性。

材料与方法



研究对象

1.1样本来源 研究对象均来自广西体检人群,超重/肥胖患者496人, 健康对照者137例。清晨空腹采静脉血4ml,枸橼酸钠抗凝,

研究论文

充分混匀,室温下2000 rpm离心20分钟,可见位于血浆与 红细胞层之间的白细胞层,用吸管将白细胞层移入离心管 中,-80℃保存用于基因组DNA的提取。血样为非抗凝血3mi, 冻存于-80℃冰箱中。 1.2样本入选标准 1.2.1肥胖患者的入选标准

根据2000年国际肥胖特别工作组提出的亚洲成年人BMI 标准:超重:BMI≥23;l级肥胖:29.9>BMI>25;
胖:BMI≥30。 1.2.2健康对照组入选标准: BMI<23,空腹血糖<5.6mmol/L或OGTT 2小时血糖 <7.8皿nol/L,且无其他内分泌疾病,无高血压病。 1.3实验分组 在mtDNA A3537G、A4824G、A5351G、C6960T多态性与 肥胖的相关性研究中,病例组包括广西体检的超重患者96 人,其中男性60人,女性36人,*均年龄46.33--+6.25 岁;肥胖患者400人,其中男性280人,女性120人,汉 族,*均年龄47.52±3.85岁。对照组包括广西地区体检的 健康对照人群137人,其中包括男性48人,女性89人,汉

2级肥

族,*均年龄45.47±5.50岁。鉴于肥胖和2型糖尿病(T2DM)
之间的密切关系,我们根据1999年WHO提出的糖尿病诊断 标准即糖耐量异常(impaired
glucose

tolerance,IGT):空

腹血糖5.6—7.0或OGTT 2小时血糖:7.8一11.1;DM:空腹 血糖)7.0或0GTT 2小时血糖)ii.1,将超重 (overweight,OW)/肥胖病组分成:单纯超重组(ow)、单纯 1级肥胖组(OBI)、单纯2级肥胖组(082)、单纯超重加肥

研究论文

胖组(OW+OBl+OB2)、超重伴糖耐量异常+2型糖尿病组
(oW+IGT+DM)、肥胖伴2型糖尿病组(oB+DM)、肥胖伴糖耐 量异常组(0B+IGT)。对照组137人,单纯超重组90人,单 纯1级肥胖271人,单纯2级肥胖17人,超重加肥胖378人,

超重伴糖耐量异常/糖尿病组16人,肥胖伴糖尿病28人,肥
胖伴糖耐量异常84人。 2试剂与仪器 2.1主要实验仪器
PCR system2400、PCR M
ll

system9700购自GeneAmp公司,2117
24D

ltiphorII电泳仪购自LKB bromma公司,DYY—III

型电泳槽、ECP3000型电源购自北京市六一仪器厂,贝克曼台

式离心机、恒温空气循环箱购自Heraeus公司,恒温水浴购
自Pharmacia Biotech公司,Gel 统购自BIO RAD公司。 2.2所用试剂及配方 EDTA、SDS、Tris碱、硼酸、蛋白酶E、无水乙醇、75% 乙醇、生理盐水均购自北京化学试剂公司。Taq DNA聚合酶
(2 units/p L),DNA marker(分子量标记)SD011购自北
Doc

2000凝胶成像分析系

京鼎国生物技术发展中心。
dNTPs(10

mM)、丙烯酰胺购自北京赛百盛基因技术有限公

司。限制性内切酶AluI、BstEII、HhaI、BgI[(10units/pL) 购自晶美生物工程北京分公司。 2.2.1提取DNA所用试剂及配方

①红细胞裂解液(灭菌):蔗糖10.9
100

g,1M MgCl2 0.5

ml,1M Tris-HCl 1 ml,Triton X-100 1 m1,加水定容至

ml,4℃保存。

研究论文

②3XMLB(白细胞裂解液):1 M
0.5 M EDTA PH--8.0 6 ml,5 M


Tris-HCl PH=8.0 3 ml,

NaCl 6 ml,20%SDS 30

m1,20 mg/ml蛋白酶K 300
100

l,DTT 0.18

g,加水定容至

ml,分装成50 ml/管,-20"C保存。(EDTA:乙二胺四乙

酸)。

③TE—I(灭菌):1
EDTA 200
Il



Tris-HCl(PH=8.O)1 m1,0.5



l,加水定容至i00 ml,高压灭菌,4℃保存。


④TE-II(溶解DNA用)(灭菌):1
1 ml,0.5 M EDTA 20


Tris-HCl(PH=8.0)

l,加水定容至100 ml,高压灭

菌,4℃保存。

⑤20%SDS:十二烷基硫酸钠20 g,加水定容至i00 ml。
⑥1


Tris(PH=7.5)(灭菌):三羟甲基氨基甲烷12.1l

g,NaOH调节PH,加水定容至i00 ml,CC保存。 ⑦0.5
H20 70 100 ml。 M

EDTA,PH=8.0(灭菌):EDTA?2H20

18.6 g,

ml,加适量的NaOH约2 g,调PH=8.0,加水定容至

⑧1 ⑨1

M Tris-HCl PH=8.0:Tris

12.1

g,H20 80 ml,

加37%HCl约4。2 ml,调节PH=8.0,加水定容至i00 ml。


MgCl2(灭菌):MgCl2?6H20
ml。

20.3 g,H20 80

m1,加水定容至100 2.2.2电泳试剂配制:

①5xTBE电泳缓冲液:称量Tris碱1089,硼酸559, 加入装有800ml蒸馏水的烧杯中,再加入0.5mol/L
EDTA

(PH=8.0)40ml,混匀后加蒸馏水定容至1000ml,常温贮存 于棕色瓶子中。用时稀释到1×(聚丙烯酰胺电泳)。 ②0.5mol/L EDTA(PH-8.0):称量186.ig
EDTA-Na2H20

研究论文

加入装有800ml蒸馏水的烧杯中,用磁力搅拌器剧烈搅拌, 用Na0H调PH值至8.0(需加入№oH将PH值调至接*8.0时, 才能完全溶解,约需209NaOH颗粒),定容至1L,分装后高
压灭菌备用。

③30%聚丙烯酰胺凝胶(29.1):称量丙烯酰胺299,N, N,_亚甲基双丙烯酰胺19,加蒸馏水混匀后定容至lOOml,常
温贮存。

④10%过硫酸胺:称量过硫酸胺19,加蒸馏水lOml, 混匀后可于4℃贮存数周。 ⑤0


loading

buffer:称量3.729 EDTA-Na2H20加

入蒸馏水90ml,充分溶解后调PH值至8.0(或用20ml
0.5mol/L EDTA(PH=8.0)),在溶液中加入ig SDS,0.259溴

芬兰,0.259二甲苯青,209聚蔗糖(Ficoll 400),充分混
匀后加蒸馏水定容至lOOml,常温贮存备用。 3实验方法

3.1基因组腻A的提取(圭晰宅捞
^k-800c冰箱中取出准备好的冻存血细1,加入4倍体积裂红液

(c卜5.C),混匀,离队2500rpm,lQnin,弃上清。重砉乏一次,至细
胞团呈粉色。沉淀白细胞:/m/x.8倍体积生理盐水,混匀,离心2500 r脚,lOmin,弃上清;加3ml裂白液、10IIIg/ml蛋白酶E
1096 SIS

颠f蛩辟昀,离0,2500rpm,20min;吸b苛于韦揩中,力aJx.2倍体
积冷无水乙醇,轻摇至DNA析出,用7096乙醇冼DNAl ̄3次,真空干 燥,溶于TE缓冲液,一2矿C保存。

400Ⅱ1,混匀,37。C温浴过夜;加八1/4黼NaCl,
200 u 1、

研究论文

3.2

P僳反应

反应体系如下. 体积(u1)

Taq眦聚合酶
10×P僳buffer
心珊)s

0.5|11


lil

0.4p1 2Ul O.3上王1 O.3Ul

DNA模板 上游引物

下潲吻
H20

14.5u1

反应条件女玎下:
^3537G A4824G ^5351G c6960r

95℃420s 95℃420s
95℃420s

95℃301s

56℃30s 56X230s

72℃60js 72℃60s 72.1260s 72℃60s

72℃420s 72℃4208 72℃420s 72℃420S

35 35 35 35

95℃30s
95℃30s

5l℃30s 59℃308

95℃锄s

95℃30s

引物如下:
Snp名 称 上游(forward) 下游(reverse) 引物序列(方向:5’--3’) 产物长度
Tm℃

bp

A3537G

A1℃C^c研℃(酊丌1(耵LTCT

O[m广L虻I℃^A1D(邛cT礤T

557

56 56 51

A船24G
A5351G

c[)cOG^^^A1瑚m姗^T^ 缸呶吣殴颤K暖润
埘醴西ld埘矧稻棚翻A
AAT^CAGAOCA^GAGOCn℃


505



研究论文

3.3酶切反应

酶懈(37。C 12h)-即3.8111,10XBufferTAI惦01.0|‘1,
1.t

内切酶(10 u/u L)0.2

1,PCR产物5

IJ

1。

sNP名称 限制性内切 作用序列 酶
A35∞G
Alul BstEII

酶切后片断长度

^GlCr GIG皿lAoC
G l a3C G0四DD孙I l NGGC

557bp一453bp,104bp 658bp一385bp,273bp
505bp--333bp,172bp 541bp-*144bp,397bp

A鹩24G
A535lG _C69仪疆 3.4

maI BgII

896聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳: ①将凝胶板垂直夹在电泳槽中,两块凝胶板之间灌满

lxTBE缓冲液,凝胶板外有少量lxTBE缓冲液缓冲液即可。

②将PCR产物5 u 1和6



loading buffer 1

11

1混合,

小心加入凝胶加样孔,避免出现气泡,正确连接电泳槽正负 极,恒定电压150V电泳约20min,至染料达到凝胶边缘,停 止。 4资料的统计分析 采用SPSS分析软件,计数资料用率表示,组间比较采 用x2检验(组中数据如有小于5的即采用p-fisher方法计

算),计量资料用均数±标准差描述。计量资料组间比较采
用t检验。






mtDNAA3537G、A4824G、A5351G、C6960T位点PCR产物及

研究论文

酶切的凝胶电泳结果(见Fig 2—1到Fig 2-4) PCR—RFLP法确定mtDNA A3537G、A4824G、A5351G、C6960T 位点多态性。(1)当mtDNA3537A突变成G时,失去了内切 酶Alul的酶切位点AG l CT。PCR产物经内切酶AluI酶切后

可电泳分为两种基因型,即从纯合子(453,104bp);GG
纯合子(557bp)。(2)当mtDNA4824A突变成G时,失去了 内切酶BstEII的酶切位点G l GTNACC。PCR产物经内切酶

BstEII酶切后可电泳分为两种基因型,即从纯合子(385,
273bp);

GG纯合子(658bp)。(3)当mtDNA 5351A突变成

G时,具有内切酶HhaI的酶切位点G I CGC。PCR产物经内切

酶HhaI酶切后可电泳分为两种基因型,即从纯合子
(505bp);

GG纯合子(333,172bp)。(4)当mtDNA

6960C NGGC。

突变成T时,失去了内切酶BgII的酶切位点GCCNNNN l

PCR产物经内切酶BgII酶切后可电泳分为两种基因型,即cc 纯合子(144,397bp);TT纯合子(541bp)。 2广西人群肥胖实验分组的确定 (1)我们首先采用WH01998年规定的欧洲成年人体重划 分标准对广西体检样本进行的超重和肥胖的分组,即:OW为 30>BMI≥25。0B>30。把体检样本分为超重/E胖组:400人(其 中单纯肥胖者组17人,单纯超重者组271人)和正常对照组 (227人),2组之间进行比较。观察A3537G、A4824G、A5351G 三点突变率的分布情况。(见Table 2-1) 统*峁⑾秩阒校粒担常担保堑惚湟炻试诹阶橹浯嬖诓 异,但是只有单纯0W组(P:0.018,95%CI:1.13—3.67)

和单纯OB+OW组(P:0.017,95%CI:1.13—3.64)差异有
统计学意义,单纯oB组(P:0.317,95%CI:0.45—7.63)差

研究论文

异没有统计学意义。考虑可能是WHO欧洲成年人体重划分标
准不适合中国人群,导致0B样本数量不足,分析出现偏差。

遂决定采用中国成年人体重划分标准再分组。 (2)采用1994年制定的中国成年人体重划分标准对广 西体检样本再次进行超重和肥胖的分组,即:OW为 27>BMI>=25,0B>27。把体检样本分为超重/肥胖组:400人 (其中单纯肥胖者组128人,单纯超重者组160人)和正常对
照组(227人),2组之间比较。观察A3537G、A4824G、A5351G 三点突变率的分布情况。(见Table 2-2)

统*峁⑾秩阒校粒担常担保牵粒矗福玻矗 2点变异率在两组之
间存在差异, A5351G点变异率,仍然只有单纯oW组(P: 0.002,95%cI:1.36—6.26)和单纯OB+OW组(P:0.017, 95%CI:1.13-3.64)与健康对照组比较中差异有统计学意义, 单纯oB组(P:0.443,95%CI:0.55—3.52)差异仍无统计

学意义。M824G点单纯0w组变异率在两组间,差异有统计
学意义(P;0.027,95%cI:0.15-0.98)。2次标准统* 果中都发现,在A5351G,A4824G 2点变异率与对照组的比

对中,单纯0W和对照组非同一人群,而单纯oB组和对照组
却是同一人群,单纯oW和单纯0w+oB组与对照组比较,统 计学差异明显,而单纯0B组却没有显著性,结果不能解释。 考虑到广西人群大部分源于马来人,决定根据2000年国际

肥胖特别工作组提出的亚洲成年人BMI标准,对实验样本再
次分组。 (3)根据2000年国际肥胖特别工作组提出的亚洲成年人

BMI标准:超重BMI≥23,1级肥胖:29.9>BMI>25,2级
肥胖:BMI≥30,对原实验样本进行重新分组,并从原广西公

研究论文

务员体检样本中补充超重样本96人,健康对照组剔除含超
重90人,形成超重/肥胖组:496人(其中单纯超重者组:90 人,单纯肥胖者组:288人),正常对照组(137人)。再次比 较2组人群中,A3537G、A4824G、A5351G三点基因型的分布 情况。(见Table 2—3) 统*峁⑾郑醚侵薇曜挤肿椋阒校粒担常担保堑惚 异率在两组之间存在差异,单纯oB组(P:0.006,or=3.53, 9596cI:1.28一io.54)和单纯oB+0W组(P:o.009,OR=3.3, 95%CI:1.22—9.7)差异有统计学意义。此分组中Ow组未显 出统计学差异考虑可能为补充ow样本不足所致。因此最终

确定分组标准采用2000年国际肥胖特别工作组提出的亚洲
成年人BMI标准。 3作用基因的确定 (1)A3537G、A4824G、A5351G三点之间单倍型分析。 实验结果中,A3537G、A4824G、A535163点之间有4种基 因型,分别为:1.(5351)A(4824)A(3537)A,2.(5351)
G(4824)A(3537)A,3.(5351)A(4824)G(3537)A,

4.(5351)A(4824)A(3537)G。各基因型分布情况。(见
Table 2-4)

统*峁⑾郑冢车阒兄挥谢蛐臀ǎ担常担保牵ǎ矗福玻矗
A(3537)A的单纯oB组和单纯OB+OW组与对照组比较中差 异有统计学意义,单纯oB组:X2-7.41,P=O.006,OR=3.53,
95%CI=I.35-6.29,

单纯超重+肥胖组

X2=1.952,P=O.009,OR=3.3,9596CI=1.28—5.70。为确定在广 西体检人群中对超重/肥胖起作用的突变点,故再次对
A5351G。A48246

2个突变点进行单倍型分析,观察基因型分

研究论文

布。
(2)A5351G A4824G 2突变点间单倍型分析

实验结果中,A3537G、A4824G 2点之间有3种基因型, 分别为:(5351)A(4824)A,(5351)A(4824)G,

(5351)6(4824)A。各基因型分布情况。(见Table 2—5)
统*峁允荆诨蛐臀ǎ担常担保牵ǎ矗福玻矗恋牡ゴ

0B组和单纯OB+OW组和对照组比较中差异有统计学意义(单
纯oB组:Xz_7.41,P=O.006,OR=3.53,9596cI=1.35-6.29。 其他基因型各组在2组比较间均无统计学差异。因此可以确

定,A5351G突变点可能是造成广西人群肥胖作用的基因上的
突变点。 但因A3537G.A4824G,2点均在A5351G上游,而且A3537G

位于NDI基因,A4824G,A5351G位于ND2基因。故欲确定位
于基因ND2是为单独与广西体检者超重/肥胖的相关的风险 基因,还需观察A5351G点下游的其他基因的SNP多态性分

布,观察是否有与5351G所在基因共同发生作用的基因突变
位点。

(3)选出线粒体ND2基因下游~紧邻基因COl基因中的一
个SNP—C6960T。电泳酶切,区分基因型(CC,TT),观察C6960T 点多态性在广西人群中的分布情况。A3537G.A4824G,
A5351G,C6960T

4点各基因型多态性的分布与对照组比较。

(见Table 2-6)

统*峁⑾郑茫叮梗叮埃缘愀髯榈谋湟炻试诓±楹徒】
对照组之间的比较中差异并无统计学意义。同样
A3537G.A4824G 2点各组的变异率在2组之间比较中差异也

无统计学意义。只有A5357G点在单纯oB组和单纯oB+OW组

研究论文

的变异率与健康对照组的比较中差异有统计学意义,单纯0B 组:X2=7.41,P=O.006,OR=3.53,95%cI=1.35-6.29。单纯 oB+0W组:r=6.75,P=O.009,OR=3.30,95%CI=11.28—5.70。 因此可推断造成广西体检人群肥胖与A5357G突变点所在基 因ND2有关。
4 A3537G.A4824G,A5351G,C6960T

4点多态性与超重/

肥胖的关系(见Table 2-7) 统*峁⑾郑挥校粒担常担保堑阍诘ゴ浚埃伦橥槐渎视虢 康对照组的比较中差异有统计学意义,单纯0B组:xk7.41, P=O.006,OR=3.53,95%CI=I.35-6.29。其他各点突变率在 各组中均无统计学意义。
5 A3537G.A4824G,A5351G,C6960T

4点多态性与超重/

肥胖伴糖尿病或糖耐量异常的关系 (1)由于肥胖和T2DM有着密切的相关性,我们进一步分 析A3537G.A4824G,A5351G,C6960T 4点多态性与肥胖伴糖 尿病的关系。(见Table 2—8)

统*峁⑾郑恚簦模危 A3537G.A4824G,A535 1G,C6960T 4
点突变率在2组间均无统计学显著性差异。 (2)分析A3537G.A4824G,A5351G,C6960T 4点多态性 与肥胖伴糖耐量异常的关系。(见Table 2-9)

统*峁⑾郑恚簦模危 A3537G.A4824G,A5351G,C6960T
4点中只有A5351G点突变率在0B+IGT组和对照组间差异存 在统计学意义,OB+IGT组:XZ=8.296,P=O.004,OR=4.40, 95%CI=1.49-9.63。其他组无统计学差异。 (3)分析A3537G.A4824G,A5351G,C6960T 4点多态性与

超重伴糖尿病/糖耐量异常的关系。(见Table 2—10)

研究论文 统*峁⑾郑恚簦模危 A3537G.A4824G,A5351G,C6960T

4点突变率在两组间差异均无统计学意义。可能是由于0w组 人数较少,造成了统计学偏差。mtDNA
A5351G,C6960T
A3537G.A4824G,

4点多态性与超重伴糖尿病/糖耐量异常的 4点的单倍体

关系还有待进一步的研究。
6 mtDNA A3537G.A4824G,A535 1G,C6960T

分析(见Table 2—11) 统*峁允荆ケ缎臀粒粒牵玫幕蛐驮冢沧榧洳钜齑 在统计学意义P=4.OE-4。

研究论文





Fig

2-1

polymorphism

of

A3537G.I'.DNA Izdd目Ma&er.23.5.6:

genetype AA(453p、104bp);4:genetype

GG咖)

Fig 2-2 polymorphism

ofA4824G.I'.DNA蛐Marker;Z6:gemype
AA C385p、273bp)

GG(658bp);3.4.5:genetype

研究论文

Fig 2-3 polymorphism

ofA5351G.1:DNAladderMaA%,6:gmetype

Fig 2-4 polymorphism of C6960T.1

:DNAI.add盯

MⅡh蠕345够n螂TT(397p.144bp):6:genetype OC(541bp)

研究论文





T_able2-1DistributionofA3537G、A4824G、A5351G standard

mutation rateinEurope

Euro

5351 GG 3 14 0.11 2.88 O.7争勺.59 32 13 0.018 2.20 1.13—3.67 34 13 0.017 2.20 1.13—3.64 254 214 239 214 AA 16 215 GG 1 25

4824 AA 18 204 0.44 0.45 0.06-1.47 17 24 0.082 O.57 0.30_0.94 17 24 0.052 O.63 0.28_0.88 271 203 254 203 GG


3537

多态性
0B control P OR 95%CI 0W

AA
18 215 O.88 O.85

14

0.11-2.76 19 13 0.561 1.24 O.6伊-2.06 19 13 0.685 1.16 269 214 252 214

control
P OR 95%CI 0B+OW control P OR 95%CI

0.56_1.92

研究论文

1抽k2-2Distribution ofA3537『G、A4824G、A535lG
standard

mutation rate in China

china

5351 GG 10 13 AA 118 214 0.443 1.4

4824

3537
AA GG 10 13 AA 118

多态性
OB control P OR 95%C1 0W control P OR 95%CI OB+0W control P

GG 10
24

118
203

214 0.443
1.4

0.396
0.72

0.55-3.52
24 13 0.002 2.9 1.36-6.26 34 13 o.017 2.20 254 214 136 214

0.31-1.64
7 24 153 203

0.55-3.52 9 13 15l 214 0.966 0.98 O.38_.2.53 19 13 0.685 1.16 O.56—1.92 269 214

0.027
O.39 O.1孓勺.98 17 24 271 203 0.052 O.53 0.28-旬.88

OR
95%CI

1.13_3.64

研究论文
1[’曲lc2-3Distribution ofA墅87G、A4824G、A5351G standard mutation rate in Asia

Asia

535i 6G 34 5 0.006 3.53 1.28—10.54 8 5 0.09 2.58 O.73—9.34 42 5 0.009 3.3 1.22-固.7 336 132 82 132 AA GG 17 13

4824 AA 271 124 0.. .77 O.6 O.27—1.35 1l 13 0.512 1.33 O.52-3.35 28 13 0.441 0.76 0.37-1.61 350 124 32 8 79 124 GG 19 8

3537 AA 269 129 0.765 I.14 0.46-2.92 13 8 0.07 2.72 l—7.57 346 129 0.325 1.49 O.64.-3.6l 77 129

多态性
OB

254
132

control
P OR

95%CI
OW control P OR 95%CI OB+OW control P OR 95%CI

40

研究论文

AAA

Othen

GAA

Others

AGA

OtheB

AAG

Othem

OW
Control

66

24



82

1l

79



85

111

26



132

13

124



129

x2


1.87

276

0.429

0.008

0.172

OJ097

O.512

0.928

OR

0.64

2.58

1.33

0.95

95%a
OB

0.34-2.05

0.81.5.51 34 254

0.57-2.87 271

O.30-2.03 269

218

70

17

19

Control

111

26



132

13

124



129

X2


1.507

7.41

1.82

0.09

0.22

O.006

0.177

0.765

OR

0.73

3.53

0.6

1.14

垒5%CI

o.44-1.∞
284 94

1.35矗29
42 336

o.28.1.07

0049乏02
24 354

OB+OW
Control

28

350

111

26



132

13

124



129

X2

1.952

6.75

o.595

o.045



0.162

0.009

o.441

o.832

OR

O.71

3.3

0.76

1。09

95%a

0.44-1崩

1.28-5.70

O.38.1.32

O.48.1.89

41

研究论文
'Ihble2-5Distribution ofA4824G、A5351Ggene type
AA 0thers 19 18 2.531 0.112 O.57 0.28-2.04 237 119 1.426 0.232 0.7 0.39.1.95 308 119 2.054 0.152 O.67 0.38-1.72 70 18 28 13 0.595
o.441

AG
11

Others 79 124 O.429 0.512 1.33

GA 8 5 2.762 0.097 2.58

o伍ers

OW
control x2 P OR 95%C1 OB control

71 119

82 132

13

O.57..2.87 51 18 17 13 1.82 0.177 O.6 O.28.1.07 350
124

O.8l-5.51 34 5 7.41 o.006 3.53 1.35.6.29 42 5 6.75 0.009 33 1.28.5.70 336 132 254 132

271 124

X2


OR 95%C1

OW+oB
control

X2

oR

0.76 0.38-1.32

95%C1

研究论文

6960

5351

4824

3537

Tr

cc

GG

AA

GG

AA

GG

AA

OW
Control



85



82

11

79



85



129



132

13

124



129



O.9:28

o.097

0.512

0.928

OR

0.95

2.58

1.33

O.95

95%cl OB

0.30.2.03 12 276

0.81.5.51 34 254

O.57.2.87 17 271

O.3她.03
19 269

Control



129



132

13

124

8 0.09

129

X2


0.579

7.41

1.82

0.447

0.006

0.177

0.765

0R

0.70

3鄹
1.35_6.29 42 336

o.6

1.14

95%a OB+OW
Control

O.28-1.24 17

0.撩1.07
28 350

0.49-Z02 24 354

361



129



132

13

124



129

X2


0.392

6.75

们95
0.441

0.045

0.531

0.∞9
3.3

0.832

0R

0.76

0.76

1.09

9_5%a

0.32-1.31

1.28-5.70

0.38.1.32

0.48.1.89

研究论文
Table2-7Relationship between overweight/obesity and the polymorphism
of 6960

A35三盯GA48:}4G,A5351G,059印fr
5351 4824 3537

Tr

CC

GG

AA

GG

AA

GG

AA

OW
control



85



82

11

79



85



129



132

13

124



129

X2


0.008

2.762

0.429

0.008

0.928

O.097

0.512

O.928

OR

0.95

2.58

1.33

O.95

95%Cl

O.30-2.03

0.81.5.51

0.57-2.87

0.30-2.03

OB

12

”6
129

34

254

17

27l

19

269

control





132

13

124



129

x2

0.579

7.41

1.82

O.∞
0.765



0.447

O.006

0.177

0R

0.70

3.53

O.60

1.14

95%C1

0.28.1.24

1.35_6.29

O.28.1.07

0.49-2.02

研究论文
Table2-8Relationship between OB+DM and the polymorphism of

A墅|3J7(0洱824G,A5351G,C回印T
6960 Tr CC 29 130 O.437 O.508 050 O.06-1.44 GG 2 3 1.674 o.196 3.17 0.51-9.20 5351 AA 28 133 GG 5 14 4824 AA 25 125 GG 2 9 O.001 o.969 1.03 3537 AA

oB+DM
Control x2 P OR

1 9

28
130

1.叽5
o.299 1.79 0.59-5.32

95%a

0.21-3.∞

Table2-9Relationship

between

OB+IGT

and the polymorphism of

A3537GA482dG,A5351G,a6960r
6960 Tr OB+IGT Control x2
P oR 4

5351 cc 80 129 GG 12 5 8.296 0.004 4.40 1.49-9.63 AA 72 132 GG


4824 AA 80 124 1.639 0.2 0.48 0.15.1.04 GG 5 8

3537 AA 79 129 0.001 0.972 1.02 n32.2.21

8 0.118 0.732 0.81

13

95%CI

O.24-1.75

研究论文
Table2-10Relationship between

A3537GA4824G,A5351G,删r
5351 CC 17 130 GG 1 6 0.057 0.811 1.30 O.15-4.66 AA
17

OW+DM/IGT and

the polymorphism of

6960 Tr

4824 GG 3
14

3537 AA 15 125 GG


AA 17 130

OW+DM+IGT
Control

1 9 O.023 0.881 O.85

133

9 0.023 O.881 0.85

x2


0.147 O.702 1.36 O.28.5.29

0R

95%Cl

0.10-3.04

O.10.3.04

Haplotype Associations
Blockl Freq Case,control Ratios AAAC AAGC AGAC 0.768 0.0912 0.077 0.043 0.017 222:52,750:242 10:264,106:886 26:248,72:920 16:258,38:954 0:274,22:970 Chi square 3.534 12.769 1.496 2.122 6.184 0.0601 Pvalue

4.0E4
O.2212 0.1452 O.0129

GA盯
GAAC

研究论文





线粒体是真核细胞内的重要细胞器,是核外唯一含有 遗传效应物质的细胞器。它是细胞的能量工厂,细胞产生的 能量的95%来自线粒体中的氧化磷酸化,其功能包括能量代 谢,参与细胞的凋亡过程,维持细胞的钙、铁离子*衡,以 及参与其他生命活动的信号传导。 线粒体在细胞中的多种功能使线粒体遗传学的多样性更 为复杂。与线粒体病病理发生相关的线粒体氧化磷酸化有3

个重要作用,①产生能量,②产生活性氧(R0s),③调节细
胞凋亡。 由于特殊的生物学环境和遗传学地位,mtDNA更容易发 生突变。目前解释其突变率高的原因有:mtDNA呈裸露状态, 没有组蛋白的保护,容易受到侵害;线粒体内缺乏较有效的 修复系统;复制时有不对称状态,出现的单链DNA有自发的 脱氨基效应;复制频率和次数较nDNA高。

1981年Anderson等发表了人类mtDNA全序列。芬兰的
数据显示人群单个点突变(3243A>G)的比率为1:6000,然 而,英国资料表明mtDNA疾病的患病率或易患比率为1:
3500乜’3]o

1988年Holt和WallaceHl分别在线粒体脑病和

Leber。s遗传性视神经病(LHON)患者的细胞中发现了mtDNA 突变,从此开辟了研究mtDNA突变与人类疾病的新领域。随 着对mtDNA研究的深入,人们对mtDNA的突变和人类疾病的

相关性日益重视。到目前为止动物模型和人类研究证据均证
明,mtDNA突变是人类疾病的重要病因之一。

值得注意的是,某种线粒体疾病往往并不限于某一特定

研究论文

位点的突变,不同患者可以检出几个不同的位点,但这些不 同位点的突变在疾病的严重程度上或影响的范围上不相同。 例如,已经证实至少有4个特异位点上发生点突变,都可导

致Leber遗传性视神经病(LHON)畸1。类似例子还有线粒脑肌
病、乳酸中毒、中风样发作综合症(MELAS)、神经性肌无力、 运动失调及糖尿病等。同样,同一位点发生的突变也可能导 致不同的疾病。 目前由于线粒体DNA突变导致的疾病有线粒体脑肌病、

乳酸酸中毒、中风和某些内分泌*约膊〉取T谧*的研
究中发现,线粒体也是类固醇合成和胰岛素分泌的必要条

件,骨骼肌内线粒体ATP合成减少是遗传性或后天获得性胰
岛素抵抗和糖尿病的特征表现倒。 人类线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一个 含有16569个碱基的双链闭环分子,一为重链,一为轻链, 二者均有编码功能,编码两种rRNA(16s和22s),22种tRNA 及13种与细胞氧化磷酸化有关的酶蛋白亚单位,这13种亚单 位与核DNA编码的其它单位一起共同组成呼吸链。线粒体DNA 这37种基因排列紧凑,基因内无内含子。

呼吸复合体I(眦DH脱蓟髯黜)亚基l,A4824(;和h5351G突
变位于N02基因,其表囟孙蛔够堤I呼吸复合体I(№DH脱氢酶复
合体)亚基2,c6960fr突变位于c0I基因,其表达产物是细胞色素 氧化酶亚基l。

本实验中,A3537G突变位于N01基因,其表达的产物为

N02编码的№DH脱勃晦则亚基2是悔成呼吸复合体I的七

个线粒体DNA编码亚单位之一。位于ND2基因区域的位点突变 可能造成:N02基因表达的异常-叫必DH脱氢酶复合体亚基2的含量

研究论文

异常一呼吸复合体I功能的异常—影响线粒体的氧化磷酸化过程

(影响A1P的产生豳蛩—咦红响^、体的能曩玳谢。
在肝脏及肌肉等糖代谢旺盛的组织,呼吸链中多肽的异 常或量的减少,除了影响氧化磷酸化,还会干扰三羧酸循环 的顺利进行,如NADH脱氢酶结构异常或量的减少,可导致线 粒体内NAD+量的不足,阻碍异柠檬酸脱氢酶、Q酮戊二酸脱 氢酶、苹果酸脱氢酶发挥正常的功能,因为这几个酶都以NAD+ 作为其辅酶。三羧酸循环的*勾罅恳阴8福廖薹ㄕ 利用,严重干扰了周围组织葡萄糖的代谢,造成胰岛素抵抗。 由于乙酰辅酶A可以转而进入细胞质参与糖异生和脂质的合
成,因此也可能对脂质的合成也有一定的影响。

相关的研究发现有:(1).ND2基因中5178A—C突变导致 腺嘌呤变为胞嘧啶,这种氨基酸的变化可能与长寿有关‘”。 (2).日本的一项研究发现,在5178点为A的男性中,血清高
密度脂蛋白明显高于在5178点为C的男性。在5178点为A的女 性中,甘油三酯含量明显低于在5178点为C的女性。提示

5178A有抗动脉粥样硬化的作用嗍。(3).有关A5351G点与肥胖 的相关性的研究目前国内外还没有报到过。

NDl基因编码的姐蹦脱氢骣复洽体亚基1是高度粼的蛋白

质,存笛个跨膜Q一螺旋二级结构,当NDl基因中错义突变影
响该蛋白二级和三级结构的形成或稳定性时,即可引起NADH
脱匐翳复合体亚基1活性的改变,缶抄乎吸复合体I功能发生*

进而导致某些疾病的发生。 在一项研究中发现,当NDl基因中3394点T突变为C时,第 30位密码子由原来编码的酪氨酸(TAT)被组氨酸(cAT)替 代,可能影响该蛋白质二级和三级结构的形成或稳定性,引

研究论文

起ND一1酶活性的改变使复合物I功能发生*佣跋煲 岛B细胞的功能,最终导致糖尿病的发生。 NDl基因的功能重要性也同时在Leber氏遗传性视神经病 (LHON)、Parkinson病、AD等疾病中已经被证实。 细胞色素氧化酶:CO(cytochrome oxidase,COX)是 细胞核DNA(nDNA)基因组和mtDNA基因组分别编码的亚基共 同组成的复合物IV,是线粒体呼吸酶系调节细胞产能的关键 酶。所有哺乳动物细胞的C0都由13个亚基组成,其中最大的 三个亚基(COl,II和Ⅲ)由mtDNA编码,其序列高度保守。其 中C01基因总长约1544bp,能与与血红索a(heme a)、血红素 a3(heme a3),CuA结合。 相关的研究发现有:(1).COI基因突变表达的细胞出现 C0活性降低和活性氧簇的产生增加,这提示CO的缺陷可能直 接参与AD病的形成。(2).mtDNA COI基因突变可致过度的细胞 凋亡和MDS病人的血细胞减少,增力IMDS病人的发病率。(3).

COI的结构和表达异常与*端性肌病有一定联系。(4).脑病综
合症与COI基因异常的错义突变点有关。 本试验试图发现这4个位点突变与广西人群超重/肥胖 和糖耐量异常/糖尿病发生的相关性。
Rebecca

L.CANN等1983年对来自不同大洲的112例人

群的mtDNA进行群体研究时,首次发现A3537G及A5351G多 态位点,同时发现A3537G及A5351G是两个同义突变。A3537G 位点在本实验所分各组中的变异频率分布均无统计学意义 (p>O.05)。说明在广西地区人群中该位点与肥胖及肥胖 伴糖耐量异常/糖尿病的发生可能无关。 本研究发l见在广西地区A535lG在单纯0B组和OB+IGT组变异频

研究论文

率分布氰缴水学差异(单纯OB组:x期.41,P=O.006,OR=3.53,
98%cI-1.35_6.29。013+IGr组:x2=&296,P=O.004,OR=4.40, 95%CI=I.49-9.63),说明该位点突变可能与广西人群肥胖的发 生和肥胖患者的糖耐量异常产生相关。在OB+DM组以及 OW+DM+IGT组中的变异频率分布均无显著性差异(p>0.05), 提示其与肥胖伴糖尿病的发生和超重伴糖耐量异常/糖尿病 的发生可能无关。 由于A5351G是同义突变点,因此,本实 验此位点结果提示2种可能:(1)在A5351G突变点周围可 能存在造成广西人群肥胖和肥胖伴IGT的风险基因突变点。 (2)虽然A5351G突变点是同义突变点,不会影响它所编码 的蛋白质的氨基酸序列,在翻译后蛋白功能上可能没有什么 意义。但是,在翻译前的过程中如转录或转录前的一些影响 可能导致呼吸链中多肽含量的减少,这种变化除了可以影响 氧化磷酸化,还会干扰三羧酸循环的顺利进行,如NADH脱 氢酶结构异常或量的减少,可导致线粒体内NAD+量的不足, 阻碍异柠檬酸脱氢酶、a酮戊二酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶发 挥正常的功能,因为这几个酶都以NAD+作为其辅酶。三羧酸 循环的*勾罅恳阴8福廖薹ㄕ@茫现馗扇帕酥 围组织葡萄糖的代谢,易造成胰岛素抵抗。还由于乙酰辅酶 A也可以转而进入细胞质参与糖异生和脂质的合成,因此也 可能对脂质的合成也有一定的影响。因此在这种角度考虑, A5351G点突变也是有一定意义的。但以上2种可能还有待进 一步研究证实。
Shin—ichiro

Ikebe等1995年对5名日本帕金森病患

者测序时发现A4824G位点突变使得苏氨酸被替代为丙氨酸, 此改变可能通过影响ND2基因产物的二级结构使细胞容易受

研究论文

到氧化损伤,可能导致酶复合体活性降低或酶的亚单位数量 减少,从而影响黑质纹状体神经元的功能。该位点在本实验 所分各组中的变异频率分布均无显著性差异(p>0.05)。 说明在广西地区人群中该位点与肥胖及肥胖伴糖耐量异常/ 糖尿病的发生可能无关。 C6960T突变位于c0 l基因,也属于同义突变,编码细 胞色素氧化酶亚基1,该位点在本实验所分各组中的变异频 率分布均无显著性差异(p>0.05)。同样说明在广西地区 人群中该位点与肥胖及肥胖伴糖耐量异常/糖尿病的发生可 能无关。 由于此四个位点位置相*约3kb左右,故将它们联合进 行单倍性分析。我们共检出五种单倍型分别为AAAC、AAGC、 AGAC、GAAT及6AAC,所有单倍型在各组的分布频率见结果4 表16。由表16可以看出单倍型AAGC在病例一对照组中的分 布有显著性差异(P=4.OE-4),提示该基因型可能为一种风 险基因型(thrifty genotype),当生活水*日益提高时,使 存在有此基因的人可能极易迅速超重或肥胖,导致胰岛素分 泌缺陷和胰岛素抵抗,增加患2型糖尿病的危险。 目前,国内外还没有关于线粒体ND2基因与肥胖和糖尿病 相关性的报导,本实验中发现的A5351G点提示在它的周围很 可能存在有与广西人群肥胖和糖耐量异常的发生相关的危 险基因突变位点。因此建议后续的实验选取A5351G阳性样本 的DNA对ND2基因片段,甚至周围的相邻基因片段进行测序、 比对寻找SNP,继续探寻与肥胖和糖尿病发生相关的基因变 异和对致病功能上的继续探索。这不仅有助于临床对肥胖和 糖尿病做出正确的病因诊断、针对性治疗,而且将使我们更

研究论文

好的理解机体内糖脂代谢的分子机制,为在人群中深入开展 更常见的肥胖病、2型糖尿病等多基因病的防治打下基础。
小 结

1.广西人群肥胖实验分组标准应该采用2000年国际肥 胖特别工作组提出的亚洲成年人BMl分组标准。 2.A5357G点突变与广西体检人群肥胖的发生相关。与广 西体检人群超重没有相关性。
3.mtDNA A3537G.A4824G,A5351G,C6960T 4点突变可

能与广西体检肥胖患者中糖尿病的发生无相关性。 4.A5351G点突变与广西体检肥胖患者中糖耐量异常的发
生相关。
5.mtDNA A3537G.A4824G,A5351G,C6960T

4点突变与

超重组糖尿病/糖耐量异常在本实验中无明显相关性。

6.基因型AAGC(G为5351点A突变成G)是广西人群肥 胖和糖耐量异常的风险基因型。 参考文献

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研究论文





1在大连糖尿病患者Foxa2基因启动子和外显子中 并未发现突变点。大连2型糖尿病人群的糖尿病
发病并非由Foxa2的基因突变所引起。

2广西人群肥胖实验分组标准应该采用2000年国际 肥胖特别工作组提出的亚洲成年人BMl分组标准。


A5357G点突变与广西体检人群肥胖的发生相关。 与广西体检人群超重没有相关性。
mtDNA A3537G.A4824G,A5351G,C6960T



4点突变

可能与广西体检肥胖患者中糖尿病的发生无相关
性。


A5351G点突变与广西体检肥胖患者中糖耐量异常
的发生相关。
mtDNA A3537G.A4824G,A5351G,C6960T



4点突变

与超重组糖尿病/糖耐量异常在本实验中无明显
相关性。

7基因型AAGC(G为5351点A突变成G)是广西人 群肥胖和糖耐量异常的风险基因型。





综述一

Foxa转录因子及其功能研究进展
Foxa转录因子家族被发现已经有15年的历史。研究证 实,Foxa转录因子可与多种编码糖异生酶、糖酵解酶、血 清蛋白以及激素的基因顺式作用元件特异性结合,在胰腺、 肝脏和脂肪等代谢性组织的分化及组织代谢的调节中发挥 着重要作用。本文将对Foxa转录因子及其功能研究进展做 一综述。


Foxa基因家族 叉头蛋白(Forkhead蛋白)转录因子家族由多种拥有

不同功能的转录因子组成,在多种细胞的代谢过程中发挥着 重要作用。fhk基因(Drosophila
fork

head,fhk)具有

严格的细胞核定位和表达蛋白特有的结构特征,其表达蛋白 与已知的蛋白质之间没有氨基酸的同源性,因此被确定为新 的核调节蛋白Ⅱ1。 Fhk基因的特殊结构域是一个含有一个核心和两个可以 与DNA靶分子相互作用的环状结构组成的单体乜3,由于该单 体含有一个Q螺旋和两个翼样的环状结构,所以也被称为 “有翼螺旋”结构。Dirksen ML等人的研究发现,从酵母到 人类不同种系的fhk基因中,均含有这一特殊的能与DNA结 合的结构域口删。 Clark等人利用十年的时间,克隆出了100多种fhk基 因家族的成员m1。为了统一不同实验室的命名和便于归类,

提出采用Fox(Forkhead box)作为脊椎动物叉头蛋白





(forkhead)转录因子的符号。 1991年,Lai E等人采用Northern Blot技术,利用
HNF一3

d探针从大鼠的肝脏中发现了第一个“有翼螺旋”蛋
a、HNF一3

白家族,将其成员分别命名为HNF一3
HNF-3

B和

y(即Foxal、Foxa2和Foxa3),他们的分子量分别为50 kD和42 kD婵1。三种蛋白质具有相同的DNA结合区

kD、47

域,但其编码区不同,且与DNA的亲合力也不尽相同。

1992年,Avrahamn们等人利用种间杂交小鼠进行限制性
内切酶多型性(RFLPs)分析,发现鼠Foxal基因定位于12号

染色体上,鼠Foxa2基因定位于2号染色体上,鼠Foxa3基 因则定位于7号染色体的*侧区。1994年,Deleuze㈣等人利 用同源性分析方法发现,人类Foxa2基因定位于20号染色
体上。1997年,MinchevaⅡ21等人应用荧光原位杂交技术确定 了人类Foxal基因的定位,发现其位于染色体14q12一q13上,

还精确定位了人类Foxa2基因位于染色体20pll位置,人类
Foxa3基因位于染色体19q13.2-q13.4位置上。

研究发现,Foxal和Foxa2蛋白是内胚层衍生器官如肝 脏、胰脏、肺和前列腺正常发育所必需的因子,因此Foxa2 的缺失可导致胚胎死亡。Foxa蛋白通过调节肝脏、胰脏和脂 肪组织中多种靶基因的表达来调节葡萄糖的代谢。*年的研
究发现,Foxa蛋白是作为一个“先驱因子”结合到启动子上, 通过一系列作用,从而增强其他组织的特异性转录n”。

遗传学分析显示,Foxal是激活胰高血糖素所必需的物 质,Foxa3可诱导糖异生酶的激活,因此具有防止饥饿状态
下低血糖的发生的作用Ⅱ盯。

Foxa家族还是胰岛a细胞内胰高血糖素基因激活的必





需因子,但它们对胰高血糖素基因的作用的方式还不十分清

楚。Sharma等在应用序列比对、分子特征蛋白质一DNA定位 技术和瞬时转染分析技术发现,人类和鼠类Foxa蛋白可与
能和其保守的结合位点结合的启动子结合,增强胰岛Q细

胞的胰高血糖素专一性启动子的活性,间接地激活胰高血糖
素基因。和以前的研究结果不同的是,胰高血糖*舳由 的Foxa结合位点不是位于细胞核的Foxa2而是位于Foxal

上,这可以解释为什么Foxal缺乏的小鼠胰高血糖素基因表
达水*较低。此位点定位在TATA box的上游(between-30

and一50),提示Foxa的作用不仅通过直接激活转录,而且
在结合胰高血糖素基因转录的起始位点打开染色质方面也 有作用“”。
2 2.1

Foxa基因功能研究进展
Foxal

2.1.1维持出生后的生命活动 有研究者通过同源融合法建立了Foxal基因敲除小鼠 (Foxal-/-)模型n¨”,用于研究Foxal的功能。结果发现, 缺乏Foxal的胚胎于细胞可以形成并分化成胚胎体,对于 这些胚胎体的基因表达分析发现,多个基因表达上调,如葡

萄糖转运体2(Glut2)和丙酮酸酶,提示Foxal是糖酵解
酶的抑制剂。Foxal基因敲除小鼠虽然出生时体重与野生型 相似,但出生后不久即出现明显的生长迟缓,且一般在出生 后2"--14天死亡。这些结果提示,Foxal在出生后的生命维 持中发挥着致关重要的作用。 2.1.2维持体内血糖的动态*衡 有研究发现Foxal基因敲除小鼠的血糖水*明显低于正





常对照组,表明发生了严重的低血糖症,同时血浆胰岛素水 *降低和皮质类固醇水*升高,与此同时血浆胰高血糖素水 *降低。后来的研究结果证实,Foxal是胰高血糖素基因启 动子的激动剂,故Foxal基因敲除小鼠血浆胰高血糖素水* 低于正常,提示这个基因是维持体内血糖动态*衡必要的转
录调节因子。
2.2

Foxa3

2.2.1调节肝细胞Glut2表达

在一项研究中发现,在Foxa3基因敲除的小鼠
(Foxa3_/9中,参与糖元异生的一些酶类mRNA表达水*上 调,同时,Foxa3基因敲除小鼠在饥饿的情况下,肝细胞膜 上的葡萄糖转运体Glut2的mRNA降低了64%,而在进食的情 况下其降低程度更加明显,达到93%,因此导致新合成的葡 萄糖向外转运*恢土粼诟蜗赴凇U庑┙峁崾荆 Foxa3是肝细胞Glut2表达的主要转录调控子u“。 2.2.2维持长期饥饿过程中体内血糖的动态*衡 为了能探讨Foxa3的功能,Shih首先通过同源融合法 培养了Foxa3缺乏的纯合子小鼠(Foxa3-/-),这种Foxa3 基因敲除小鼠可以生存下来。这种基因敲除小鼠从幼年到成 年,其生长指数与正常小鼠比较没有明显差异,生理性指标 检查如餐后血糖、甘油三酯、氨基酸和胆固醇水*也没有明 显差异。然而,Foxa3基因敲除小鼠肝脏的Foxal和Foxa2 表达都明显增高,提示在Foxa基因家族成员之间存在一个 潜在的相互调节网络n钔。进一步的研究发现,Foxa3基因敲 除小鼠血浆胰岛索和胰高血糖素水*与对照组相似,而肝细 胞膜Glut2明显降低,缺乏这种蛋白转运体会阻碍从肝脏细





胞内合成的糖转运至细胞外,从而导致Foxa3基因敲除小 鼠(Foxa3-/-)饥饿状态下的低糖血症,提示Foxa3是持 续饥饿状态维持体内血糖动态*衡所必须的物质乜“。
2.3

Foxa2

2.3.1维持内胚层来源组织的特异性和功能 研究发现,通过同源融合法而获得的Foxa2基因敲除 小鼠的胚胎,发育至i0~iI天时会发生死亡昭“221。小鼠胰 腺的发育开始于胚胎发育的第9.5天左右跚。在三种Foxa

基因中,Foxa2是最早在小鼠胚胎体中检测到的Foxa基因位“。
Foxa2在肝脏的原始细胞中呈现高表达状态,到胚胎发育的

第16.5天,内胚层来源的组织——胰腺也出现Foxa2高表
达,这一高表达状态可从胚胎早期持续到成人期,提示其在
维持内胚层来源的组织如肝脏、胰腺和肺的组织特异性和功 能中发挥着关键作用。 2.3.2调节转录因子网 通过人工表达载体、转染实验和DNA结合分析等方法 发现,多种编码肝脏和胰腺的酶类、血清蛋白和激素的基因 上都含有Foxa的结合位点。通过对来源于Foxa2-/-胚胎体 的内脏内胚层进行分析晗“,发现Foxa2缺失即可导致转录因 子HNFlⅡ和HNF4a的mRNA表达量明显减少,同时可使 Foxal转录子和血清脂蛋白完全不表达。提示Foxa2可以 调节编码分化和代谢过程中需要的转录因子网。与此相反, 缺乏Foxal的胚胎同样显示了Foxa2靶基因的上调,提示 Foxal是一个比Foxa2弱的转录激活剂。由于Foxal和 Foxa2可以竞争靶基因上相同的DNA结合位点,因此, Foxal缺乏便可允许更多的Foxa2结合在靶基因上,导致更
60





强的Foxal靶基因转录。 2.3.3在胰腺发育中的作用和功能 有学者采用了Cre-loxP重组系统建立了胰岛B细胞 Foxa2特异性敲除小鼠(Foxa210xP/10xP:Ins.Cre)模型㈨。 该小鼠胚胎可以成活到出生,出生第l天,与野生型小鼠 难以区别,但是几天后即显示了明显的胰腺异常,胰岛排列 紊乱,提示Foxa2在胰脏发育和胰岛形成中发挥重要作用。 生理检查发现,该小鼠有严重的低糖血症,餐后血糖水*很 少达到野生型小鼠的25%,常常在出生后9到12天死亡, 提示Foxa2在血糖维持和糖代谢过程中的特殊作用。 通过RT—PCR法分析胰岛B细胞Foxa2特异性敲除小 鼠的胰岛发现,糖刺激后Glut2、
(Glucolkinase)和谷氨酸脱氢酶

葡萄糖激酶
(glutamate

dehydrogenase)的表达在野生型和变异型具有明显的不同, 提示这些在胰岛素分泌过程中的蛋白质表达都依赖于
Foxa2。

此外,体外试验还发现,Foxa2是胰脏发育所必需的一 个同源基因Pdxl上游区的一个主要调节因子。Pdxl也是维 持体内葡萄糖*衡的一个重要因子。为了研究Foxa2/Pdxl 在胰腺13细胞分化时的调节作用,Lee利用胰岛B细胞特
异敲除Foxa2小鼠观察了Foxa2缺乏对Pdxl的影响,结果

发现,胰岛13细胞特异敲除Foxa2小鼠胰岛PdxlmRNA表达 明显下调,胰岛PDX-1蛋白水*明显降低阱1。 2.3.4在饥饿状态下肝细胞内基因表达转录调控中的作用 在饥饿状态下,血浆胰岛素水*降低,胰高血糖素和糖 皮质激素水*增高,分别通过活化cAMP应答元件结合蛋白





(CREB)和糖皮质激素受体(GR)而促进糖异生作用。Foxa 的转录结合位点常与CREB和GR的结合位点相邻。 有实验通过应用Foxa2基因敲除小鼠作为在体研究模型, 研究Foxa2在cAMP和糖皮质激素介导的肝细胞特异性基 因PEPCK(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)、TAT(酪氨酸氨基转移酶) 和IGFBP—l(胰岛素样生长因子结合蛋白1)转录活化中的 作用和分子机理。研究发现肝细胞Foxa2基因特异性敲除 小鼠中PEPCK、TAT和IGFBP—l基因在饥饿状态下mRNA 表达明显受抑;体外实验结果显示肝细胞中PEPCK、TAT和 IGFBP一1基因mRNA表达对不同的激素信号刺激,其应答有 明显不同,即cAMP是机体在饥饿状态下PEPCK基因应答 的主要信号通路,而糖皮质激素则是机体在饥饿状态下TAT

和IGFBP-1基因应答的主要信号通路;Foxa2通过与其靶基
因(PEPCK、TAT、IGFBP-1)的结合而促使转录因子CREB和 GR以及它们潜在的辅助因子到达其靶基因的顺式作用元件, 从而实现了活体内细胞对胰高血糖素和糖皮质激素的应答。 以上研究提示,肝细胞特异性因子Foxa2是cAMP和糖 皮质激素介导的肝细胞特异性基因PEPCK、TAT和IGFBP_1 转录活化所共同必需的,它与两个广泛表达的依赖于激素的 转录因子cR髓、GR的整合保证了糖异生作用只发生在肝脏 及在肝脏特定的代谢条件下盥町。 2.3.5在脂肪细胞的代谢及分化方面的作用

Foxa-2在原脂细胞中就有表达,在遗传或饮食导致的肥
胖动物模型的脂肪细胞中可被诱导。在原脂细胞中,Foxa-2 通过激活Pref-1基因的转录抑制脂肪细胞的分化。在原始 的原脂细胞中生长激素可以增强Foxa-2及Pref-l的表达,





这一现象提示,生长激素抗脂肪形成的作用可受Foxa-2的 调控。在已经分化的脂肪细胞中,Foxa-2的表达诱导参与葡 萄糖及脂肪代谢的基因表达,这些基因包括葡萄糖转运子 -4、已糖激酶一2、肌肉一丙酮酸激酶、激素敏感的脂肪酶以 及解偶联蛋白一2和解偶联蛋白一3。单一Foxa-2缺乏(Foxa-2 班)小鼠通过饮食引导与同窝出生的野生型小鼠相比更易发 展为肥胖,而且这些Foxa一2廿小鼠的脂肪细胞在葡萄糖摄 取及代谢方面存在缺陷。这些结果显示,Foxa-2在脂肪细胞 的代谢及分化方面作为生理性调节因子发挥着重要的作用
伽】


Foxa2可活化肝脏内脂类代谢基因,这一过程可被胰岛 素所调节。在肝脏内,Foxa2激活可以促进脂肪酸的氧化和 (或)以三酰基甘油的形式分泌,而在2型糖尿病中这一过
程发生*#疲铮幔餐ü校纾悖 p被共同激活,

在ob/ob

小鼠肝脏中腺病毒表达Foxa2和Pgc-1 B可导致肝脏三酰基 甘油含量的减少并导致血浆三酰基甘油浓度增加。此外,
Foxa2/Pgc-1 B可诱发微粒体转移蛋白的表达,从而增强包

含VLDL的脱辅基蛋白B(apoB)的分泌,这个过程可通过 Foxa2依赖机制被胰岛素抑制。这些结果表明,
Foxa2/Pgc一1 B可通过在胰岛素作用下脂类的氧化和/或分

泌来增强脂肪酸的清除,调节肝内脂类*衡侧叭1。 2.3.6在胰岛素抵抗和糖尿病发生中的作用 胰岛素抵抗综合征时出现的慢性高胰岛素血症,可引起 Foxa2滞留在胞浆内而抑制其转录功能,因此而加重肝脏的 脂质堆积和胰岛素抵抗啪,。 在胰岛素抵抗时,响应胰岛素的蛋白质依次磷酸化的过





程发生*璋艘鹊核囟蕴呛椭敬坏恼5鹘凇R 岛素抵抗人群出现的高血糖,部分是因为肝脏葡萄糖异生作 用增强所致。尽管胰岛素抵抗/糖尿病病人的胰岛素不能抑 制糖异生过程,但却能够抑制脂肪酸氧化过程。因此,胰岛 素抵抗人群不仅血糖升高,而且还存在甘油三酯不能被氧化 分解而在肝脏堆积现象。 有实验通过转染一个位于细胞核内持续活化的且不能 被胰岛素抑制的由腺病毒表达突变的Foxa2(又称T156A), 用以观察阻断胰岛素磷酸化反应对Foxa2的影响。当突变的 Foxa2T156A导入糖尿病鼠的肝细胞后,不仅逆转了肝脏脂肪 变性,减少了肝脏甘油三酯的含量,而且提高了肝脏对胰岛

素的敏感性,减少了葡萄糖的合成,使血糖正常化,血胰岛
素水*明显降低。而这些变化又和脂肪酸氧化作用中基因编 码酶的表达增加,生酮作用和糖酵解相关联的啪1。该研究 结果解释了胰岛素对糖代谢和脂代谢的影响,并为肝脏脂肪 变性如何发生并引起糖尿病提供了线索。

2.3.7调节胰岛素分泌
在某些疾病中,胰腺B细胞胰岛素分泌调节发生* 包括成人型(2型)糖尿病及幼儿持续高胰岛素血症引发的

低血糖症(P删I)。最早的PHHI小鼠模型是通过在胰腺B
细胞选择性的敲除转录因子Foxa-2基因而建立。对分离出

的胰岛组织进行处理时发现,Foxa-2缺乏导致了胰岛素过度
分泌,并且葡萄糖刺激胰岛素分泌现象丧失。大多数PHHI 病例与SURI(磺脲受体1)或KIR6.2(内向整流器钾通道参 数6.2)的突变有关,后者编码ATP一敏感钾通道的亚单位。 突变小鼠胰岛的原位杂交显示,这两个基因的表达都是





Foxa-2依赖性的。研究者利用表达亚型来识别Foxa-2的附 加靶点,令人惊奇的是,这些基因中的Hadbsc编码短链L-3一 羟酰辅酶A脱氢酶,该酶的缺乏可导致人类的PHHI发生。 Hadbsc是Foxa-2的一个直接靶点,对分离的胰岛进行体内 染色质免疫沉淀实验与协同转染的结果都证明了这一点。因 此认为Foxa-2作为一种重要的基因激活物在调控胰岛素分 泌的多种途径中均发挥作用∞1。 2.3.8调节人类胰岛素样生长因子1(IGF-1)的表达 人类胰岛素样生长因子1(IGF-1)的启动子1(P1) 在成年人肝脏中大部分是有活性的。Foxa2对PI的活性有 很强的刺激作用。转染试验结合带移试验和DNase I(胰脱
氧核糖核酸酶)足迹法分析显示,在P1*侧启动子区有2

个Foxa2的结合位点。这2个在进化中是相当保守的结合位 点需要最大程度的转活。对/#忆F-3突变体的构建研究显示,
IGF-1的表达也是间接地通过Foxa2增加Foxal表达的作用

而产生的。这样显示Foxa2调节人类活体IGF-1的表达是通 过2种不同的机制嘲。




Foxa蛋白的三个家族成员Foxal、Foxa2和Foxa3表 达方式不同,功能也不相同。在哺乳动物生命过程的不同阶 段扮演着重要的角色。从早期发育开始,到器官的发生,最 后到代谢调节和内环境稳定中都起到了关键性的作用。随着 细胞生物学和分子生物学技术的不断发展,Foxa基因敲除 或组织特异性基因敲除动物模型的不断建立,我们可以更好





地理解这些转录因子在基因调控网络和维持血糖动态*衡 中的重要作用。

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20 Kaestner

KH.,Hiemisch

H.,and

Schutz

disruption of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 3

gamma

results

in

reduced

transcription

of

hepatocyte-specific

genes【J】.Mol

Cell

Biol,1998,

18.4245~4251
21

Shen.W:Scearce LM,Brestelli JE,Sund NJ,Kaestner KH.
Foxa3 is required for the regulation of hepatic GLUT2
expression and the

maintenance of glucose homeostasis

during
42817 22 Ang



prolonged

fast[J].J

Biol Chem,2001,276,42812,--,

SL Rossant J.HNF-3 beta is essential for node and
formation

notochord

in

mouse

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23

Weinstein

DC,Ruiz I Altaba A,Chen

WS.The

einged—helix

transcription factor HNF-3 beta is required for notochord development in the mouse 588 24 Slack

embryo[J].Cell,1994,78,575--。

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25 Dufort
D, Schwartz factor



Harpal is



Rossant
in

J.The
visceral

transcription

HNF3beta

required

endoderm for normal primitive streak morphogenesis【耵.

Development,1998,125,3015~3025

综 26 1.antz KA,Vatamaniuk

述 MZ,Brestelli JE,Friedman JR,
Kaestner insulin KH.Foxa2 regulates

Matschinsky同Ⅵand
multiple
pathways of

secretion【J】.髓e
Mz,Matschinsky FM,
controls Pdxl
gene

JoumalofClinical Investigation.2004’114,512~520
27 Lee CS,Sund NJ,Vatamaniuk

Stoffers

DA,Kaestner KH.Foxa2
in pancreatic

expression

beta—cells

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vivo.

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28 Zhang

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integrates the
to

KH.Foxa2 hepatoeyte

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differentiation

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the

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Mechanisms

of

Nuclear

Coactivator

PGC?1.Hereditas(Beijing),2005,27(2):302~308 31孙亮,金峰,王沥,杨泽.核辅激活因子PGC-1作用分子机制 的研究进展.遗传,2005,27(2):302~308
32

Wolfrum
Pge-lbeta

C.Stoffel

M.Coactivation of Foxa2 through
liver fattv acid OXidation and 2006

promotes

triglyceride,、l,I.DL

secretion.CeU

Metab.

Feb,3(劲:99~110
33

Christian Wolfram,Esra Asilmaz,Edlira Friedman
and Markus
Stoffel. Foxa2

I nca,Jeffrey regulates

M.

lipid





metabolism and ketogenesis in the liver during fasting and in

diabetes【J】.Nature 2004;432,1027"--1032
34

Wrolfrum.C,Asilmaz.E,Luca.E,Friedman
Foxa2 regulates lipid metabolism liver during fasting and in 1031

J.M,Sto彘l。M,

and

ketogenesis in the

diabetes.Nature.2004,432,1027~

35 Kristen

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nuclear factor 3beta

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indirect manner

direct

and

fJl

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综述二 线粒体DNA突变与遗传疾病
线粒体是真核细胞重要的细胞器,其功能包括能量代 谢,参与细胞的凋亡过程,维持细胞的钙、铁离子*衡,以 及参与其他生命活动的信号传导。早在1963年,Nass等人 就发现在线粒体内有遗传物质DNA。198 1年Anderson等发 表了人类mtDNA全序列。1988年Holt和Wallace分别在线 粒体脑病和Leber’s遗传性视神经病(LHON)患者的细胞中 发现了mtDNA突变,从此开辟了研究mtDNA突变与人类疾病 的新领域“矗1。随着对mtDNA研究的深入,人们对mtDNA的突 变和人类疾病的相关性日益重视。芬兰的数据显示人群单个 点突变(3243A>G)的比率为1:6000,然而,英国资料表明 mtDNA疾病的患病率或易患比率为1:3500口J1。动物模型和

人类研究证据均证明,mtDNA突变是人类疾病的重要病因之
一o 1线粒体基因遗传学 1.1mtDNA的结构 线粒体存在于所有真核细胞内,是细胞ATP氧化磷酸化 (OXPHoS)的主要场所,参与呼吸链的电子转移(复合物I —IV)和ATP合酶(复合物V)的形成。受核DNA(nDNA)和 mtDNA双重遗传调控。人类的mtDNA全长为16596bp,为非 常紧凑环状双链DNA,其外环为重链(H),内环为轻链(L),除 有1个与DNA复制起始有关的87bp的D环(又称D-Loop) 外,其他基因均无内含子。人类mtDNA上有37个编码基因,





其中有13个蛋白质基因,包括1个细胞色素b基因,2个 ATP酶复合体基因,3个细胞色素C氧化酶亚单位基因及7 个呼吸链NADH脱氢酶亚单位的基因.另外,在D环后还有2
个rRNA 02s rRNA、16S rRNA)和22个相间排列的tRNA基

因。除ATPase与C03这两个编码基因外,其他的编码基因 都由相邻的tRNA基因间隔开的。由于tRNA基因与rRNA基 因及其他蛋白编码基因都以交错方式排列,因此tRNA基因
就作为核酸酶切割的识别信号。
1.2

mtDNA的复制、转录和翻译 人、鼠和鸟类组织中,传统的复制机制是轻链与重链并

列复制。现认为mtDNA复制出现链置换,其复制过程中2条 DNA链在不同的时间开始,一条前导,另一条随后。首先进行 H链的合成,在复制起点处以L链为模板,合成l条RNA引 物,然后由DNA聚合酶y催化合成1个500’600bp长的H链 片段。该片段与L链以氢键结合,并将亲代的H链置换出来, 产生1种D环复制的中间物。新的H链片段在核酸*艘 构酶和螺旋酶的作用下继续完成复制。L链的合成则以被置 换下来的亲代H链为模板,在距H链合成起点60%基因组 的位置开始合成L链DNA,合成过程也需要RNA引物。最 *,D一环起始复制区和这两种复制模式一同成为争论的焦点
Is-s]


人类mtDNA,在两条链同时发生转录,线粒体RNA聚合酶 (POL跳T)需与TFAM,线粒体转录因子B1(TFBlM)或B2(TFB2M) 共同作用。每个mtDNA分子只有1个位于D环区的启动子, 转录开始于rRNA基因的前端,按顺时针方向围绕整个DNA 连续转录,在tRNA基因的两端把各基因转录产物切开,最后
73





终止于D环。除ATPase6和C03基因外,所有转录的产物均 被剪切为单顺反子,再进一步加工为成熟的mRNA。 13种mtDNA编码的OXPHOS蛋白的mRNA在线粒体核糖体 被翻译。由于线粒体基因的排列极为紧凑,除D控制区外都 是基因编码区。因此,线粒体基因组的解码可以由数量很少 的tRNA系统完成,其基因编码也不同于核DNA的方式,启 动子和终止子采用极为压缩的方式进行连接,有时甚至重叠 好几个碱基。线粒体tRNA或rRNA突变可使线粒体翻译中断
【9】


1.3

mtDNA的遗传特性 线粒体基因组遗传具有3种基本特性:(1)mtDNA的标

准遗传模式是严格的母系遗传。(2)mtDNA突变时,异质型 细胞在有丝分裂和减数分裂过程中,正常和突变的mtDNA随 机分配到子代细胞中,这样经多次分裂后可产生野生型,突 变同质型和突变异质型细胞,这种分离现象称为随机分离。 (3)多态现象在mtDNA中较为普遍。


mtDNA突变 由于特殊的生物学环境和遗传学地位,mtDNA更容易发

生突变。目前解释其突变率高的原因有:mtDNA呈裸露状态, 没有组蛋白的保护,容易受到侵害;线粒体内缺乏较有效的 修复系统;复制时有不对称状态,出现的单链DNA有自发的 脱氨基效应;复制频率和次数较nDNA高。目前对这些假设还

无一致认识,但已发现突变仍有一定的特征,即基因编码序
列比较保守.不同种属间可以看到基因序列有较高保守性, 而处于mtDNA复制控制区D一环区(D—loop),长度约为1
i22bp,

序列并不编码蛋白,在进化过程中选择压力相对较小,因而





具有较其他区域更多的多态。研究也表明,D—环的突变速 率总体上约为整个序列的lO倍。在控制区序列中,大多数突 变都发生在两段长度约为300--400bp的区域n田,被统称为第 l高变区(hypervariable segment I)和第2高变区
(hypervariable
segment

ii)。目前,大多数对于D—环序列

的测定都集中在这两个区域。 在有可能导致mtDNA突变的环境有害因子中,研究较多 的是活性氧自由基。线粒体在呼吸链代谢中产生的超氧离子 和电子转运过程中生成的羟自由基都可能对mtDNA造成损 伤。受此影响.DNA链上的脱氧鸟苷(dG)转化成羟基加成物 8—羟基脱氧鸟苷(8-OH dG),随后在DNA复制中可诱发点突 变n”。点突变的产生,提高了DNA双链的分离(separation) 机率.促使mtDNA发生进一步突变,如缺失和重排。重排 是发生在缺失之后的事件。缺失的mtDNA片段,既可能形成 细胞内的小环(minicircle)“”,也可能在mtDNA或nDNA上 造成重排,而发生在nDNA上的重排,通常较mtDNA上的重 排后果更严重更迅速。例如,激活原癌基因或使抑癌基因失 活,从而诱发肿瘤。许多资料显示,mtDNA突变有“热点” 及与之相应的序列和结构.这也许对预防和治疗因mtDNA突 变引起的疾病有所启示。 按照突变发生的细胞不同。可将mtDNA突变大致分为系 统性(systemic)和体细胞性(somatic)两类,前者是指突变 发生在母系生殖细胞mtDNA上,经过减数分裂和有丝分裂, 突变的mtDNA随机分布到子代细胞。携带一定比例的突变的 mtDNA的个体在生长发育中,其突变mtDNA经历缓慢的积累过 程.而且体内组织器官都携带损伤的mtDNA.往往在~定年





龄时由于达到了该组织器官的阈值(threshold)而表现出疾 病症状。体细胞mtDNA突变是指突变发生在出生后,例如,

与年龄相关的mtDNA突变多发生在中年到老年这一时期。它
也形成异质体(heteroplasmy)。突变mtDNA比例与能量缺损 程度大致相当,当突变积累过多时,能量输出会降到正常的 细胞、组织和器官的功能最低需要量以下。不同器官组织的 能量阈值有所不同,以中枢神经系统最高,向下依次是心脏、

骨髂肌、内分泌系统、肾、肝。即使是同一突变,随着线粒 体缺陷程度不同,其影响也有差异.从而导致不同的临床症
状。而发生在不同器官组织的mtDNA突变,造成的后果如临 床表现亦会有所不同。由于细胞所需能量的90%以上为线粒

体提供,可以想到像神经,肌肉、血小板这类耗氧能较高的
组织一旦发生mtDNh突变,其后果有多严重。 另外一方面,在发生mtDNA突变的细胞,由于突变积累需 要一定的时间,加上野生型mtDNA的补偿作用,需要有相当

比例的突变存在才能造成疾病的表现型“钉。这就形成了线粒
体疾病在中老年人中较多的特征。线粒体疾病的这种年龄相

关性,在两类ntDNA突变中都有表现。
3线粒体疾病 1988年Wallace等Ⅱ们第1改提出Leber遗传性视神经眼 病是由mtDNA突变引起,自那时以来,已有*僦旨膊≈な

或怀疑与mtDNA突变有关。表1列出一些由mtDNA突变所引起
的疾病,这些疾病也可能由于核突变或其他影响线粒功能的 情况而引起。值得注意的是,某种线粒体疾病往往并不限于 某一特定位点的突变,不同患者可以检出几个不同的位点, 但这些不同位点的突变在疾病的严重程度上或影响的范围





上不相同。例如,已经证实至少有4个特异位点上发生点突

变,都可导致Leber遗传性视神经病(LH0哟Ⅱ司。类似例子还 有线粒脑肌病、乳酸中毒、中风样发作综合症(MELAS)、神
经性肌无力、运动失调及色素性视网膜炎(NARP)等。

在mtDNA的错义突变中,LHON算是有较为定型的临床表现 的线粒体疾病,与其他相比较为典型。而在相当多的线粒体
疾病中尽管突变的基因型相同,但临床表现却不相同,或者 有较多的临床症状,给诊断带来不少困难。 非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)是糖尿病的一个皿型,在

临床诊断中需要与其他糖尿病进行鉴别,已有较多的研究资
料说明,该亚型与mtDNA上的突变相关,突变的性质为点突 变,且有母系遗传的特征,且与神经性耳聋共分离n“。 除

了这一亚型的糖尿病已经确认与mtDNA点突变有关外.其他
亚型的糖尿病患者也发现了mtDNA突变,其关系还需更多的 证明。

老年性痴呆症是严重影响老年人健康的疾病。已知有4
个染色体基因的突变或异常与AD有关,除此而外,mtDNA突 变也可能与AD有关。已经在一些AD患者的脑组织中检测到 mtDNA特异的突变。最*,用细胞学和分子生物学技术发现, 培养的神经细胞在受到活性氧自由基的作用时,不仅会产生

AD特异的beta蛋白样物质,而且该物质对mtDNA也有损伤作
用n刀,这就使老年性痴呆与mtDNA突变之间的联系有了更充 分的证据。由于mtDNA突变常常造成细胞OXPHOS功能降低并 最终导致细胞的死亡,对于许多由mtDNA突变引起的神经和

肌肉退行性疾病来说,从线粒体功能缺损对组织和器官的影
响上去理解疾病的多种表现是有意义的。但是,从表中还可





以看出,某一种疾病可以是不同的几种突变所引起,以线粒
体肌病最为突出,这个性质与上述LHON并不相同。LHON中 的4个突变都只与LHON相关,而与线粒体肌病有关的mtDNA 突变,并不仅仅是引起线粒体肌病这一种疾病,常常可以导 致另一些疾病,或者另一些疾病常常合并线粒体肌病,其原 因是否因为突变的组织器官较为广泛,还需要进一步证实。 尽管已经有相当多的线粒体疾病被证实是mtDNA突变的 原因,但在mtDNA突变中,更多的是对机体无害也无益的 “中性突变”,以一定频率存在于线粒体群体中.构成mtDNA 的多态性。同时,野生型线粒体的补偿(complementation) 对发生了mtDNA突变的细胞起到保护作用,这就使mtDNA突 变时,并不立即产生严重后果。体外实验表明,带有突变的 mtDNA的细胞并非只能朝恶性方向发展,细胞在复制分离过 程中,有相当的部分具有形成野生型同质体的倾向n“。但突 变的mtDNA复制速率往往超过野生型,这是突变得以积累的 另一个重要原因。补偿和积累是对立的,不同的组织或细胞 可能会有较大的差异。由于线粒体的数量在不同的组织细胞 中是不同的,因此,含线粒体的组织细胞,尤其是不分裂的 组织细胞.其补偿能力较低而突变积累较快,容易达到阈值。

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衷心感谢我的导师吕佩源教授在学业上的精心指导和 生活工作上的关心照顾,使我能够顺利完成课题工作。导师 严谨敏锐的科研思维、认真务实的工作作风、诲人不倦的教 学态度是我一生学*的榜样。 卫生部北京医院期刊编辑部主任于普林,老年病研究所 杨泽教授在实验设计和实验进程中给予了我耐心的指导,使 我的课题得以顺利完成,在此表示深深的谢意,2位老师丰 富的科研经验和实事求是的工作作风使我受益匪浅。感谢朱 小泉老师、中科院的孙亮博士、屈彦纯博士在实验中给予我 的指导。 由衷感谢河北省人民医院各位医护老师给予我课题工 作的大力支持;并向所有曾经关心、帮助我的老师、师兄、

师妹、同学们致以深深谢意! 感谢研究生学院各位老师及工作者的辛勤培养和热忱
关怀! 最后,我要衷心感谢我的亲人和朋友,正因为有了他们 的关心和支持,才使我能够集中精力顺利完成三年的学业。

个人简历

个人简历
、一般情况
姓名吴迪 性别男 民族汉 籍贯河北省石家庄 出生日期1980年7月6曰 二、个人简历
1999.9.2004.7

就读于河北医科大学院临床医学专
业并获得学士学位

2004.9.至今

河北医科大学攻读神经病学硕士学


三、发表论文 1于普林,覃朝晖,吴迪.北京城市社区老年人跌倒发生 率的调查.中华老年医学杂志.2006,25:305~308

2吴迪,于普林.老年人跌倒和神经系统疾病.中国神经
免疫学和神经病学杂志.2006,13(4):243~246



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